Muconsäureproduktion aus Glucose und Xylose in Pseudomonas putida durch Evolution und Metabolic Engineering

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4925 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Muconsäure ist ein bioprivilegiertes Molekül, das in direkte Ersatzchemikalien für etablierte Petrochemikalien und leistungsgesteigerte Bioprodukte umgewandelt werden kann. In dieser Studie wird Pseudomonas putida KT2440 entwickelt, um Glucose und Xylose, die primären Kohlenhydrate in Lignocellulosehydrolysaten, mithilfe einer modellgesteuerten Strategie in Muconsäure umzuwandeln, um die theoretische Ausbeute zu maximieren. Mithilfe der adaptiven Laborevolution (ALE) und des Metabolic Engineering in einem Stamm, der zur Expression des D-Xylose-Isomerase-Signalwegs entwickelt wurde, zeigen wir, dass Mutationen im heterologen D-Xylose:H+-Symporter (XylE) die Expression eines wichtigen Transporters der Facilitator-Superfamilie (PP_2569) erhöhten ) und die Überexpression von aroB, das für die native 3-Dehydroquinat-Synthase kodiert, ermöglichen eine effiziente gleichzeitige Produktion von Muconsäure aus Glucose und Xylose. Mit dem rational entwickelten Stamm produzieren wir 33,7 g L-1 Muconat bei 0,18 g L-1 h-1 und einer molaren Ausbeute von 46 % (92 % der maximalen theoretischen Ausbeute). Diese technische Strategie ist vielversprechend für die Herstellung anderer vom Shikimat-Weg abgeleiteter Verbindungen aus Lignozellulosezuckern.

Die Entwicklung wirtschaftlicher Verfahren zur Herstellung von Biokraftstoffen und Biochemikalien aus Lignozellulose wird von entscheidender Bedeutung sein, um zur Reduzierung der anthropogenen Treibhausgasemissionen im Zusammenhang mit dem Verbrauch fossiler Brennstoffe beizutragen1,2. Unter den verschiedenen Bereichen des Stoffwechselraums, die für die biochemische Produktion erforscht wurden, weisen Moleküle aus mikrobiellen aromatischen Katabolwegen eine erhebliche chemische Vielfalt auf3,4. Bemerkenswert ist, dass cis,cis-Muconsäure (im Folgenden Muconat) eine beliebte Plattformchemikalie aus dem Catechol-Katabolweg ist, die aus aus Lignin gewonnenen aromatischen Verbindungen, Kohlenhydraten und aus aus Kunststoffabfällen gewonnenen aromatischen Verbindungen hergestellt werden kann5,6,7,8,9 ,10,11,12. Muconat ist ein bioprivilegiertes Molekül13, das entweder in direkte Ersatzchemikalien wie Adipinsäure und Terephthalsäure5,14,15 oder in leistungssteigernde Bioprodukte16,17,18,19,20,21,22,23,24 umgewandelt werden kann .

Die Produktion von Muconat aus Kohlenhydraten basiert auf dem Shikimat-Weg für die Biosynthese aromatischer Aminosäuren und wurde erstmals in rekombinanten Escherichia coli5 nachgewiesen. Erythrose-4-phosphat (E4P) und Phosphoenolpyruvat (PEP) werden zu 3-Desoxy-d-arabinoheptulosonat-7-phosphat (DAHP) kondensiert, das weiter in 3-Dehydroshikimat (3-DHS) umgewandelt wird, ein Schlüsselzwischenprodukt in der Shikimate-Pfad. Von 3-DHS wurden mindestens fünf Wege für die Muconat-Biosynthese beschrieben25,26,27,28,29,30. Einer dieser Wege verläuft über das intermediäre Protocatechuat (PCA) über eine 3-DHS-Dehydratase (asbF) und führt zu einer höheren maximalen theoretischen Ausbeute als die anderen, die über Shikimat über eine Shikimat-Dehydrogenase (aroE) verlaufen (Abb. 1a). )29.

ein Schema der gesamten Metabolic-Engineering-Strategie. Um Xylose zu nutzen, wurden XylE, D-Xylose-Isomerase (xylA), Xylulokinase (xylB), Transaldolase (tal) und Transketolase (tkt) aus E. coli heterolog exprimiert. E4P und PEP wurden über eine rückkopplungsresistente DAHP-Synthase (aroGD146N)70 zu DAHP kondensiert. Um DAHP in Muconat (MA) umzuwandeln, wurden Gene, die für eine 3-DHS-Dehydratase (asbF) aus Bacillus cereus und eine PCA-Decarboxylase (aroY) sowie das entsprechende Co-Faktor-erzeugende Protein (ecdB), beide aus Enterobacter cloacae, kodieren, heterolog verwendet ausgedrückt. aroB und Catechol-1,2-Dioxygenase (catA) wurden überexprimiert3,32. Eine manipulierte Chorismatpyruvat-Lyase aus E. coli (ubiC-C22)40 wurde überexprimiert, um Chorismat (CSA) in 4-Hydroxybenzoat (4HB) umzuwandeln, das in PCA und MA umgewandelt werden kann. Gelöschte Gene werden rot dargestellt.Glucosedehydrogenase (gcd) wurde gelöscht, um die Bildung von Xylonat oder Gluconat zu verhindern. Die Glucose-6-phosphat-Isomerasen pgi-1 und pgi-2 wurden jeweils zuvor gelöscht3,32, aber pgi-1 wurde in dieser Studie wiederhergestellt. Die Pyruvatkinasen pykA und pykF wurden jeweils gelöscht, um die Konkurrenz um PEP zu verringern. Zur Akkumulation von MA wurden pcaHG und catBC gelöscht, um eine Ringöffnung von PCA bzw. einen Katabolismus von MA zu verhindern. P-Phosphat, 2-KGn 2-Ketogluconat, 2-KG-6-P 2-Ketogluconat-6-P, G6P Glucose-6-P, 6PG 6-Phosphogluconat, KDPG 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat, G3P Glycerinaldehyd-3-P, FBP Fructose-1,6-P2, F6P Fructose-6-P, S7P Sedoheptulose-7-P, R5P Ribose-5-P, Ri5P Ribulose-5-P, 3PG 3-Phosphoglycerat, CAT Catechol, SA-Shikimat, S3P-Shikimat-3-phosphat, ICIT-Isocitrat, CIT-Citrat, AKG-Alpha-Ketoglutarat, SUCC-Succinat, FUM-Fumarat, MAL-Malat, GLX-Glyoxylat, OAA-Oxalacetat, AcCoA-Acetyl-Coenzym A. b Stoffwechselmodellierung des Maximums Theoretische Mol- und Kohlenstoffausbeuten von Muconat mit oder ohne pgi-1. Die blauen Linien stellen den asbF-Weg dar, die roten Linien stellen den aroE-Weg dar, durchgezogene Linien repräsentieren % molare Ausbeute und gestrichelte Linien repräsentieren % Kohlenstoffausbeute. Die grauen Bereiche stellen den molaren Prozentsatz der verbrauchten Xylose von 33 bis 40 % (mit dem Rest Glucose) dar und ahmen die Zusammensetzung von Maisstrohhydrolysaten nach. c Schüttelkolbenkultivierungen des Stammes QP328 auf Glucose und Xylose. Die prozentuale molare Ausbeute wurde als [mM Muconat/mM (Glucose + Xylose) × 100] berechnet und die prozentuale Kohlenstoffausbeute wurde als [mM Muconat × 6/mM (Glucose × 6 + Fehlerbalken stellen die Standardabweichung biologischer Triplikate dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Mehrere frühere Versuche, Muconat aus Zuckern über asbF herzustellen, haben den Shikimat-Weg durch die Löschung von aroE10,11,31 unterbrochen. Die Deletion von aroE führt zu Stämmen, die für essentielle aromatische Aminosäuren auxotroph sind, was für einen Bioprozess unerwünscht ist10,25. Kürzlich wurden Pseudomonas putida KT2440-Stämme (im Folgenden P. putida) so konstruiert, dass sie über asbF3,32,33 effizient Muconat aus Glucose produzieren. Zuletzt berichteten wir über die Entwicklung von P. putida, die einen Titer von 22,0 g L−1 bei 0,21 g L−1 h−1 und eine molare Ausbeute von 35,6 % aus Glucose in einem pH-kontrollierten Bioreaktor erzielte32.

Bisher wurde bei den meisten Versuchen, Muconat aus Kohlenhydraten herzustellen, Glukose als Substrat eingesetzt. Allerdings ist die gemeinsame Nutzung von Glucose und Xylose – oft die beiden Hauptkohlenhydrate in Lignocellulose2 – entscheidend für die Verwertung von Biomassehydrolysaten. Die gleichzeitige Nutzung von Glucose und Xylose zur Muconatproduktion wurde bei Escherichia coli untersucht11. In dieser früheren Arbeit wurde Xylose im TCA-Zyklus verstoffwechselt, um die Unterdrückung des Kohlenstoffkataboliten (Carbon Catabolite Repression, CCR) zu vermeiden und so die Muconatausbeute zu begrenzen, was die Entwicklung anderer Strategien zur Erreichung dieses Ziels motiviert. Im Gegensatz zu E. coli ist P. putida von Natur aus nicht in der Lage, Xylose zu verwerten, was die Möglichkeit bietet, in Abwesenheit von CCR optimale Xylose-Wege zu entwickeln34,35,36,37.

In dieser Arbeit versuchen wir, die Nutzung von Xylose zu integrieren, um eine effiziente Muconatproduktion aus Glucose und Xylose in P. putida zu erreichen. Zu diesem Zweck löschen wir zunächst hexR und konstruieren den D-Xylose-Isomerase-Weg in einen Stamm, der zuvor so manipuliert wurde, dass er Muconat aus Glucose produziert (Tabelle 1). Durch die Kombination von Stoffwechselmodellierung, rationalem Stamm-Engineering, adaptiver Laborevolution und Bioreaktorkultivierung identifizieren wir erfolgreiche Strategien zur Verbesserung der Muconatproduktion aus Glucose und Xylose. Schließlich wird eine Metabolomik durchgeführt, um die Auswirkungen der genetischen Veränderungen auf den Stoffwechselfluss abzuleiten.

Drei Xylose-Stoffwechselwege wurden in Betracht gezogen, um die Produktion von Muconat aus diesem Substrat zu ermöglichen36, darunter der Isomerase-Weg, bei dem Xylose im Pentosephosphat-Weg (PPP)38, dem Weimberg-Weg, der ernährt, zu Xylulose-5-P (X5P) metabolisiert wird Xylose gelangt über α-Ketoglutarat38,39 zum TCA-Zyklus und zum Dahms-Weg40, der die ersten drei Schritte mit dem Weimberg-Weg teilt, wonach α-Ketoglutarsäuresemialdehyd durch eine Aldolase in Pyruvat und Glykolaldehyd umgewandelt wird. Unter diesen ist der d-Xylose-Isomerase-Weg, bei dem Xylose über die d-Xylose-Isomerase (xylA) und da X5P weiter in E4P umgewandelt werden kann und anschließend in den Shikimat-Weg eintreten kann (Abb. 1a)35. Wir haben den Isomerase-Weg in einen Stamm integriert, der zuvor zur Herstellung von Muconat aus Glucose, CJ5223, entwickelt wurde, indem wir Codon-optimierte Versionen der E. coli-D-Xylose-Isomerase (xylA), Xylulokinase (XylB) und des D-Xylose:H+-Symporters überexprimierten (xylE) zusammen mit einer Transaldolase (tal) und einer Transketolase (tkt) zur Verbesserung des Kohlenstoffflusses innerhalb des PPP (Abb. 1a)35. Wir haben auch hexR gelöscht, das einen Transkriptionsregulator kodiert, der die Expression von Genen steuert, die für den Zuckerstoffwechsel wichtig sind, da wir zuvor festgestellt hatten, dass dies die Umwandlung von Glukose in Muconat verbessert32.

Thompson et al. Zuvor wurde bereits berichtet, dass der Einsatz sowohl des asbF- als auch des aroE-Wegs dazu beitragen kann, die Nettovorläuferassimilation und den Metabolitenfluss in Richtung Muconat zu maximieren25. Daher wurde eine konstruierte Chorismatpyruvat-Lyase (ubiC-C22)41 mit verringerter Produkthemmung integriert, um die Muconatproduktion über den Shikimatweg über aroE zu steigern (Abb. 1a). Wir hatten zuvor pgi-1 und pgi-2, die redundante Glucose-6-P-Isomerasen kodieren, gelöscht, um den EDEMP-Zyklus zu stören, eine Kombination aus dem Entner-Doudoroff-, dem glukoneogenen Embden-Meyerhoff-Pernass- und dem Pentosephosphat-Weg42. Der Zweck der Unterbrechung des EDEMP-Zyklus besteht darin, zu verhindern, dass er während des Wachstums auf Glukose unabhängig von PEP Pyruvat erzeugt, was es der Zelle ermöglichen könnte, Kohlenstoff auf Kosten der Muconatproduktion in Richtung Wachstum umzuleiten, obwohl die Gene, die für die Pyruvatkinasen kodieren, gelöscht wurden (pykA, pykF) und PEP-Carboxylase (ppc)3. Diese Strategie ist für die Muconatproduktion aus Glucose als einziger Kohlenstoffquelle von Vorteil, aber in diesem Fall würde die Deletion von pgi-1 und pgi-2 die maximale theoretische Muconatausbeute sowohl der asbF- als auch der aroE-katalysierten Muconatbiosynthesewege verringern, wenn Xylose vorhanden ist über das PPP umgewandelt (Abb. 1b).

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass der Xyloseanteil in der Mischung aus Glucose und Xylose (Xylose/Glucose + 1 und pgi-2 gelöscht, um niedriger zu sein, als wenn einer oder beide vorhanden wären (Abb. 1b). Um die Hypothese zu testen, dass die Aktivität der Glucose-6-Phosphat-Isomerase (kodiert durch pgi-1 und pgi-2) für den Eintritt des Xyloseflusses in den EDEMP-Zyklus notwendig ist, haben wir Stämme basierend auf JE322635 erstellt, einem von P. putida KT2440 abgeleiteten Stamm wurde zuvor entwickelt, um Xylose über den D-Xylose-Isomerase-Weg zu nutzen, ist aber ansonsten ein Wildtyp und erzeugt die Stämme LC041 (∆pgi-1), LC345 (∆pgi-2), LC347 (∆pgi-1 ∆pgi-2). Bei der Plattenlesekultur auf Xylose enthaltendem M9-Medium konnte LC347 nicht wachsen, wohingegen sowohl LC041 als auch LC345 verringerte Wachstumsraten und erhöhte Wachstumsverzögerungen zeigten (ergänzende Abbildung 2). LC345 zeigte mit intaktem pgi-1 eine geringere Wachstumsrate und eine längere Wachstumsverzögerung im Vergleich zu LC041, das nur pgi-2 enthält, was darauf hindeutet, dass Pgi-1 weniger zur gesamten Glucose-6-Phosphat-Isomerase-Aktivität beiträgt als Pgi-2. Da zu erwarten ist, dass der EDEMP-Zyklus mit der Muconat-Biosynthese konkurriert und die Muconat-Ausbeute verringert, haben wir pgi-1 wiederhergestellt, um den Xylose-Fluss in den EDEMP-Zyklus zu ermöglichen und die maximale theoretische Ausbeute zu verbessern, wodurch der Stamm QP328 erzeugt wurde (Abb. 1a und Tabelle 1). .

Der Stamm QP328 wurde in Schüttelkolben auf einer Mischung aus Glucose und Xylose kultiviert, um ihre Umwandlung in Muconat zu untersuchen. Obwohl gezeigt wurde, dass der Xylose-Isomerase-Weg im Wildtyp P. putida35 effizient ist, war die Xylose-Verwertungsrate von QP328 im Vergleich zu der von Glucose sehr niedrig (Abb. 1c). Da Glukose und Xylose im P. putida KT2440-Wildtyp-Hintergrund nach Einführung desselben Xylose-Isomerase-Signalwegs gleichzeitig genutzt werden können, vermuteten wir, dass in unserem Muconat-produzierenden Stamm ein Engpass beim Xylose-Transport oder -Metabolismus vorlag.

Um die Xylose-Nutzung durch QP328 zu verbessern, führten wir ALE durch serielle Passage des Stamms auf M9-Medium, ergänzt mit 10 mM Xylose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle, durch. Mit der Passage der Populationen wurden schneller höhere OD600-Werte erreicht. Nach 7 Passagen (~50 Generationen) erreichten alle vier Abstammungslinien innerhalb von 2–4 Tagen eine Trübung, verglichen mit 14 Tagen zu Beginn der ALE, und die Evolution wurde beendet. Die entwickelten Populationen der vier Abstammungslinien wurden auf einer LB-Agarplatte ausplattiert, und drei Isolate auf jeder Platte wurden für das Vorscreening im Schüttelkolben ausgewählt (insgesamt 12 Isolate). In den meisten Fällen zeigten alle Triplikate derselben Abstammungslinie ein ähnliches Wachstum und eine ähnliche Muconatproduktion, sodass angenommen wurde, dass sie wahrscheinlich denselben Genotyp darstellten und nur eines aus jeder Abstammungslinie aufbewahrt wurde. In Linie 1 schnitt jedoch ein Replikat anders ab, sodass zwei Isolate gespeichert wurden (ergänzende Abbildung 3). Um Mutationen zu identifizieren, die zu einer verbesserten Xylose-Verwertung beitragen könnten, wurden die Genome aller fünf Isolate sequenziert. Alle fünf Isolate hatten Mutationen im Xylose-Transporter xylE (A62V, A62V und A455V, T34I, L214P, S205F, jeweils für die Isolate 1, 2, 3, 4, 5). Vier der Isolate (1, 3–5) hatten Mutationen, die wahrscheinlich aroG-D146N inaktivierten (Frameshift +7 bp, Frameshift +2 bp, M1N und L2H, Frameshift –16 bp, für Isolat 1, 3, 4, 5). ) (Abb. 2a). Die fünf Isolate wurden dann in Schüttelkolben auf Glucose, Xylose und eine Mischung aus Glucose und Xylose untersucht. Wie erwartet wuchsen Stämme mit Mutationen in aroG-D146N besser, produzierten jedoch weniger Muconat. Isolat 2 erzielte die höchste Muconat-Ausbeute und die niedrigste Biomasse-Ausbeute und wurde als QP478 bezeichnet (ergänzende Abbildung 4). QP478 zeigte ein wesentlich verbessertes Wachstum auf Xylose im Vergleich zu QP328 in einem Plattenlesegerät, in dem das Wachstum von QP328 vernachlässigbar war, während QP478 in 72 Stunden eine OD600 von 0,5 erreichte (Abb. 2b).

a Mutationen, die in ALE durch Sequenzierung des gesamten Genoms der fünf Isolate identifiziert wurden (das Sankey-Diagramm wurde mit dem Online-Tool SankeyMATIC erstellt). b Wachstumskurve der rückentwickelten Stämme LC091 und LC100, mit dem unentwickelten Stamm QP328 und dem entwickelten Stamm QP478 zum Vergleich. μA stellt die absolute Wachstumsrate dar und alle hier dargestellten μA sind die Durchschnittswerte von drei unabhängigen Wachstumskurven. c Schüttelkolbenexperimente der rückentwickelten Stämme LC091 und LC100 im Vergleich zu QP478 auf M9-Medium, ergänzt mit 30 mM Xylose. Die Ausbeute von LC100 wurde mit LC091 unter Verwendung des zweiseitigen Student-t-Tests (P < 0,0001) verglichen. d Schüttelkolbenexperimente zum Vergleich der rückentwickelten Stämme LC091 und LC100 und des entwickelten Stamms QP478 auf M9-Medium, ergänzt mit 30 mM Glucose und 15 mM Xylose. Die prozentuale molare Ausbeute wurde als [mM Muconat/mM (Glucose + Xylose) × 100] berechnet und die prozentuale Kohlenstoffausbeute wurde als [mM Muconat × 6/mM (Glucose × 6 + Fehlerbalken stellen hier die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die in QP478 identifizierten Mutationen sind in den Zusatzdaten 1 aufgeführt. Zu den Mutationen, von denen wir annahmen, dass sie mit dem verbesserten Wachstum auf Xylose zusammenhängen könnten, gehörten: (1) zwei Missense-Mutationen im Xylose-Transporter-Gen, xylE, bei denen Alaninreste durch Valine ersetzt wurden , A62V und A455V; (2) eine G→A-Punktmutation 10 bp stromaufwärts des −35-Elements eines mutmaßlichen Promotors (ergänzende Abbildung 5), vorhergesagt vom BPROM σ70-Promotor-Vorhersageprogramm43 stromaufwärts von PP_2569, das als Metaboliten-Hauptvermittler-Superfamilie annotiert ist ( MFS)-Transporter in der Uniprot-Datenbank; und (3) eine 227,8 kB große Region des Genoms von PP_5050 bis PP_5242, die scheinbar dupliziert war (Abb. 2a).

Um den Beitrag der Mutationen zu verstehen, die während ALE zu einem verbesserten Wachstum auf Xylose führten, haben wir Stämme erstellt, die die Wildtyp-Sequenzen einzeln im weiterentwickelten Stamm QP478 wiederherstellten. Die A62V- und A455V-Mutationen wurden in xylE getrennt in den Wildtyp zurückgeführt, wodurch LC093 bzw. LC078 erzeugt wurden. Die G→A-Mutation in der Promotorregion von PP_2569 wurde wiederhergestellt, wodurch LC061 entstand. In Plattenleseexperimenten führte die Wiederherstellung von entweder xylE-A455V oder xylE-A62V zu einer verringerten Wachstumsrate und einer erhöhten Wachstumsverzögerung von LC078 bzw. LC093 (ergänzende Abbildung 6a – c). Die Wiederherstellung der G → A-Mutation in PPP_2569 führte zu einer leicht verringerten Wachstumsrate (ergänzende Abbildung 6a, b). In Schüttelkolben zeigte nur LC093 eine signifikant geringere Muconat-Ausbeute im Vergleich zu QP478 (Ergänzende Abbildung 6f, g, j), aber alle drei Stämme LC061, LC078 und LC093 zeigten ein langsameres Wachstum und eine langsamere Muconat-Produktion (Ergänzende Abbildung 6g – j). Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen der Plattenleseexperimente (ergänzende Abbildung 6a – c). Die verringerte Muconatproduktivität, die durch verringerte Wachstumsraten und/oder erhöhte Wachstumsverzögerung verursacht wurde, deutete darauf hin, dass alle diese Mutationen zu einem verbesserten Zellwachstum auf Xylose von QP478 beitrugen (ergänzende Abbildung 6).

Wir haben auch das umgekehrte Experiment durchgeführt und die ALE-Mutationen in den Elternstamm QP328 manipuliert, um einen rational manipulierten Stamm zu erhalten, der nur Mutationen enthält, die zu einer verbesserten Produktion von Muconat beitragen. Wir haben zunächst den unentwickelten Stamm QP328 mit den drei Punktmutationen rückentwickelt. Die XylE-Mutationen A62V und A455V wurden in den unentwickelten Stamm QP328 eingeführt, wodurch LC091 entstand. Die G→A-Mutation in PPP_2569 wurde in QP328 und LC091 manipuliert und erzeugte LC092 bzw. LC100. Die Stämme LC091, LC092 und LC100 wurden zusammen mit QP328 und QP478 in einem Plattenlesegerät bewertet, das M9-Medium mit 30 mM Xylose enthielt. Interessanterweise ermöglichte die Einführung der beiden XylE-Mutationen das Zellwachstum auf Xylose in LC091 (Abb. 2b), das im Vergleich zu QP478 auf Xylose allein und einer Mischung aus Xylose und Glucose eine vergleichbare Wachstumsrate, aber eine höhere Endbiomasse aufwies (Abb. 2b). Die Einführung der G→A-Mutation in PPP_2569 in QP328 ermöglichte auch das Zellwachstum von LC092 auf Xylose, allerdings mit einer viel geringeren Rate im Vergleich zu LC091 (Abb. 2b). Unerwarteterweise führte die Einführung der G→A-Mutation in PPP_2569 in LC091 zu einem verringerten Wachstum und einer geringeren Biomasse von LC100 sowohl auf Xylose als auch auf gemischten Substraten (Abb. 2b).

Als nächstes bewerteten wir LC091, LC100 und QP478 in Schüttelkolben, die M9-Medium mit 30 mM Xylose enthielten. LC091 erreichte fast die doppelte Biomasseausbeute (OD600), erzielte jedoch im Vergleich zu QP478 eine geringere Muconatausbeute (Abb. 2c). Darüber hinaus erreichte LC100 eine vergleichbare Muconatausbeute wie QP478, wenn auch mit einer geringeren Rate (Abb. 2c). RT-qPCR zeigte an, dass die G→A-Mutation in PPP_2569 die Expression von PP_2569 erhöhte (ergänzende Abbildung 7). Wir haben auch LC091, LC100 und QP478 auf M9-Medium mit einer Mischung aus Glucose und Xylose bewertet. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen nur für Xylose ist die Muconat-Ausbeute von LC091 geringer als die von LC100 und QP478 in der Mischung; LC100 zeigte in der Mischung immer noch ein viel langsameres Wachstum als QP478, obwohl es gleichzeitig Glucose und Xylose nutzte und eine vergleichbare Muconat-Ausbeute erreichte (Abb. 2d). Der Unterschied zwischen diesen Stämmen deutete darauf hin, dass ein Gen oder Gene in der duplizierten Region PP_5050–PP_5242 für die verbesserte Leistung von QP478 wichtig sein könnten.

Der einzige genetische Unterschied zwischen den Stämmen LC091 und LC100 ist die G→A-Mutation in der Promotorregion, die zu einer höheren Expression eines mutmaßlichen MFS-Transporters PP_2569 führte (ergänzende Abbildung 5). Um zu verstehen, wie die Mutation bei ALE auftreten könnte, und um zu untersuchen, wie der Stoffwechsel durch PP_2569 beeinflusst werden könnte, wurden intrazelluläre und extrazelluläre Metabolomics-Experimente mit LC091 und LC100 durchgeführt, die auf Xylose gezüchtet wurden. Ausgewählte Metaboliten aus der frühen Log-Phase, der mittleren Log-Phase und der späten Log-Phase wurden analysiert (ergänzende Abbildung 8) und die Z-Scores wurden wie in Abb. 3a dargestellt. Im Allgemeinen beobachteten wir, dass LC091 mehr Metaboliten sowohl im EDEMP-Weg als auch im TCA-Zyklus anhäufte, sowohl intrazellulär als auch extrazellulär, während LC100 eine größere Anreicherung von Metaboliten im Zusammenhang mit dem Shikimat-Weg aufwies (Abb. 3a). Es gab drei prominente Ausnahmen von Verbindungen im Zusammenhang mit dem Shikimat-Signalweg, die in LC091 häufiger vorkamen, nämlich L-Tyrosin, L-Phenylalanin und L-Tryptophan, bei denen es sich allesamt um von Chorismat abgeleitete aromatische Aminosäuren handelt (Abb. 3b – d). Bei Pseudomonas aeruginosa wurde zuvor berichtet, dass L-Tyrosin und L-Tryptophan die nativen DAHP-Synthasen AroF-1 und AroF-244 stark hemmen können. Daher gehen wir davon aus, dass AroF-1 und AroF-2 in LC100 im Vergleich zu LC091 weniger gehemmt sein könnten. Obwohl eine rückkopplungsresistente DAHP-Synthase aroGD146N in unseren Stämmen überexprimiert wurde, zeigten frühere Studien, dass die nativen DAHP-Synthasen AroF-1 und AroF-2 allein zu einer PCA- und Phenolproduktion von etwa 30 % führten, verglichen mit einer zusätzlichen Überexpression von aroGD146N in P. putida45 bzw. Pseudomonas taiwanensis46. Wir kamen zu dem Schluss, dass die verbesserte Muconatproduktion von LC100 im Vergleich zu LC091 auf eine geringere Hemmung von AroF-1 und AroF-2 zurückzuführen sein könnte (Abb. 3b – e), und die verringerte PEP-Konzentration und die erhöhte Anreicherung von DAHP in LC100 stützen diese Interpretation ( Abb. 3a).

eine Heatmap der ausgewählten intrazellulären und extrazellulären Metaboliten. Z-Scores wurden anhand der durchschnittlichen Intensitäten intrazellulärer und extrazellulärer Metaboliten getrennt berechnet, und für die Analyse extrazellulärer Metaboliten wurde auch eine Zeit-Null-Kontrolle aus nicht beimpftem Medium einbezogen. b–e Intensitäten ausgewählter Metaboliten aus der späten Log-Phase, „In“ steht für intrazellulär, „Ex“ steht für extrazellulär und „ND“ steht für nicht nachgewiesen. Das intrazelluläre Intensitätssignal wurde mit dem Zellpellet einer 1-ml-Zellkultur gesammelt, und das extrazelluläre Intensitätssignal wurde mit 20 μl des entsprechenden Überstands gesammelt. f Struktur von XylE (PDB-ID: 4GBY)48 mit grün markierten Resten von ALE-abgeleiteten Mutationsstellen. D-Xylose wird in schwarzen Kugelstäbchen dargestellt. g Wachstumskurve des Stammes LC111 im Vergleich zu JE3692 auf M9-Medium, ergänzt mit 30 mM Xylose. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Eine weitere Erklärung könnte darüber hinaus sein, dass PP_2569 in der Lage ist, die aromatischen Aminosäuren extrazellulär zu transportieren – wir konnten jedoch keine extrazelluläre Anreicherung dieser Aminosäuren beobachten (Abb. 3b – d). Stattdessen fanden wir in LC100 eine erhebliche extrazelluläre Anreicherung von Anthranilsäure (Abb. 3e). Anthranilsäure ist eine Vorstufe von L-Tryptophan und ein direktes Produkt von Chorismat, einem wichtigen Knotenpunkt im Shikimat-Stoffwechselweg, aus dem alle aromatischen Aminosäuren abgeleitet werden. Es wurde berichtet, dass Chorismat intrazellulär instabil ist47 und in unseren intrazellulären Metabolomics-Proben nicht nachgewiesen wurde. Basierend auf den aktuellen Ergebnissen gingen wir davon aus, dass PP_2569 möglicherweise Anthranilsäure exportieren kann, was zu einer verringerten intrazellulären Anreicherung von L-Tryptophan führen könnte (Abb. 3d, e). Die erhöhte Anthranilsäureanreicherung kann auch den Fluss von Chorismat zu anderen aromatischen Aminosäuren verringern, was zu einer verringerten Anreicherung von L-Tyrosin und L-Phenylalanin im Stamm LC100 führt. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um die mechanistischen Grundlagen dieser vorteilhaften, von ALE abgeleiteten Mutation zu untersuchen.

Um den Mechanismus von Mutationen in Struktur (PDB-ID: 4GBY)48, was hervorhebt, dass sich die Mutationen alle in den Transmembrandomänen befanden (Abb. 3f). Zuvor haben Jiang et al. zeigten, dass die Einführung von zwei Mutationen (G58W und L315W) in XylE die Bindung zweier Inhibitoren durch Konformationsänderungen verhindern könnte49. Bemerkenswert ist, dass sich die G58W-Stelle in derselben Transmembrandomäne wie A62V und in der Struktur nahe bei T34I befindet. Da der nicht Muconat produzierende Stamm LC345 mit Wildtyp-XylE und einem ähnlichen genetischen Hintergrund wie QP328 auf Xylose gut wuchs (ergänzende Abbildung 2a), nahmen wir an, dass die Mutationen in XylE, die bei ALE auftraten, durch Inhibitoren induziert werden könnten. vom Muconat-produzierenden Hintergrundstamm. Wir haben auch die Mutationen xylE-A62V und A455V in den Stamm JE3692 eingeführt, von dem zuvor berichtet wurde, dass er auf Lignozellulosehydrolysaten wächst und LC111 erzeugt. Die beiden Stämme wurden in einem Plattenlesegerät auf Xylose untersucht. LC111 zeigte im Vergleich zu JE3692 ein verbessertes Wachstum mit einer kürzeren Verzögerungszeit und einer höheren Wachstumsrate (Abb. 3g). Die leichte Verbesserung kann durch die Spurenmengen an Inhibitoren aus den nativen Signalwegen verursacht werden, und dies könnte auch darauf hindeuten, dass die Einführung von XylE-A62V, A455V die Xylose-Nutzung für die Produktion anderer Produkte verbessern kann, die nicht mit dem Shikimat-Signalweg in Zusammenhang stehen.

Die 227,8-kB-Duplikation wurde auf der Grundlage einer etwa doppelt so hohen Sequenzierungsabdeckung von PP_5050 bis PP_5242 im Vergleich zum Rest des Genoms identifiziert (Abb. 4a). Aufgrund der kurzen Leselänge der Illumina-Sequenzierung50,51 war es jedoch schwierig, die genaue Position der duplizierten Region anhand der Sequenzierungsdaten zu identifizieren. Wir haben daher die ursprüngliche Region von PP_5050–PP_5242 in QP478 gelöscht und dabei die bekannten Sequenzen außerhalb der Region als homologe Arme verwendet, um LC171 zu erzeugen, und einen Teil der Duplikation von PP_5084–PP_5242 gelöscht, um den Stamm LC173 zu erzeugen. Auf 30 mM Xylose in M9-Medium zeigte LC171 mit Deletion der gesamten Region eine geringere Wachstumsrate, während LC173 mit teilweiser Deletion ein vergleichbares Wachstum mit einer etwas längeren Wachstumsverzögerung und einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu QP478 zeigte (Abb. 4b). Basierend auf diesen Ergebnissen kamen wir zu dem Schluss, dass die Duplikation für die Leistung von QP478 wichtig ist und dass sich die potenziell vorteilhaften Gene in der Region PP_5050–PP_5083 befinden sollten, die in LC173 intakt bleibt. Daher versuchten wir als nächstes, die Gene in dieser Region zu identifizieren, die zum verbesserten Wachstum auf Xylose beitrugen.

a Identifizierung der duplizierten Region aus Sequenzierungsdaten der nächsten Generation, die etwa das Zweifache der Anzahl der Sequenzierungslesungen in QP478 sowie vollständige und teilweise Deletionen dieser duplizierten Regionen in LC171 bzw. LC173 darstellten. Die Abdeckungsdiagramme wurden in Geneious Prime 2020.0.4 erstellt. b Wachstumskurven von QP478, LC171 und LC173 auf M9-Medium mit 30 mM Xylose. λ stellt die Wachstumsverzögerung dar, μA stellt die absolute Wachstumsrate dar und beide sind die Durchschnittswerte von drei unabhängigen Wachstumskurven. c Überexpression von Kandidatengenen im rückentwickelten Stamm LC100 an der ΔpykF-Stelle. d Wachstumskurven von QP478, LC100, LC199 und LC224 auf M9-Medium mit 30 mM Xylose. e Maximale spezifische Wachstumsraten, extrahiert aus Panel d. f Wachstumsverzögerungswerte, extrahiert aus Panel d. g–i-Profile in Schüttelkolbenexperimenten des Stamms LC224 auf M9-Medium mit 30 mM Xylose, 30 mM Glucose + 15 mM Xylose bzw. 30 mM Glucose. Für Schüttelkolbenexperimente wurde die prozentuale molare Ausbeute als [mM Muconat/mM (Glucose + Xylose) × 100] und die prozentuale Kohlenstoffausbeute als [mM Muconat × 6/mM (Glucose × 6 + ]. Fehlerbalken stellen hier die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da Glucose und Xylose in LC100 beide mit ähnlich geringen Raten genutzt wurden (Abb. 2d), schlussfolgerten wir, dass sich das langsame Wachstum in Teilen des von beiden Zuckern gemeinsam genutzten Signalwegs manifestieren könnte. Drei Kandidatengene innerhalb PP_5050–PP_5083 wurden für die Überexpression in LC100 ausgewählt, darunter eines im Zusammenhang mit dem Zuckerstoffwechsel, PP_5056 (gpmI, 2,3-Bisphosphoglycerat-unabhängige Phosphoglyceratmutase), und zwei im Shikimat-Signalweg, PP_5078 (aroB, 3-Dehydroquinat). Synthase) und PP_5079 (aroK, Shikimatkinase) (Abb. 4c). Zwei weitere Gene außerhalb dieser Region, die jedoch mit dem Zuckerstoffwechsel zusammenhängen, wurden ebenfalls getestet, darunter PP_5085 (maeB, Äpfelsäureenzym B) und PP_5150 (rpiA, Ribose-5-Phosphat-Isomerase A). Überexpressionskassetten der fünf Gene wurden dann einzeln an der ΔpykF-Stelle eingefügt, wodurch die Stämme LC147 (gpmI), LC150 (maeB), LC151 (rpiA), LC199 (aroK) und LC224 (aroB) erzeugt wurden. Alle diese Gene wurden vom Ptac-Promotor gesteuert, mit Ausnahme von gpmI, das nach zwei erfolglosen Versuchen, das Gen mithilfe von Ptac in das Genom einzufügen, vom Plac-Promotor gesteuert wurde. Die resultierenden Stämme wurden dann mit LC100 und QP478 in einem Plattenlesegerät mit M9-Medium und 30 mM Xylose bewertet (Abb. 4d – f). Die Überexpression der drei mit dem Zuckerstoffwechsel verbundenen Gene in LC100 verringerte die Wachstumsverzögerung nicht, während die Stämme LC150 und LC151 höhere Wachstumsraten und eine größere Endakkumulation der Biomasse aufwiesen (ergänzende Abbildung 9). In Anbetracht der Tatsache, dass ein höherer Biomasseertrag die Muconatausbeute verringern kann, wie wir es beim Stamm LC091 beobachtet haben (Abb. 2b – d), haben wir beschlossen, diese Ziele nicht weiter zu verfolgen. Die Stämme LC199 und LC224, die aroK bzw. aroB überexprimieren, zeigten beide verbesserte Wachstumsraten und eine geringere Wachstumsverzögerung im Vergleich zu LC100 (Abb. 4d–f). LC224 wuchs sogar schneller als QP478 mit einer ähnlichen Verzögerungszeit und einer höheren Wachstumsrate (Abb. 4d – f).

Um den möglichen additiven Effekt der Überexpression von aroK und aroB zu untersuchen, exprimierten wir auch aroK und aroB in einem Operon-ähnlichen Muster als aroKB in LC100, wodurch der Stamm LC168 entstand. Die Stämme LC199, LC224, LC168 und QP478 wurden in Schüttelkolbenexperimenten mit M9-Medium, das Glucose und Xylose enthielt, bewertet, um die Muconatproduktion zu untersuchen. Der aroB-Überexpressionsstamm LC224 übertraf sein entwickeltes Gegenstück QP478 mit einer höheren Muconatausbeute und einer verbesserten Wachstumsrate (ergänzende Abbildung 10a, c), was darauf hindeutet, dass die Reaktion von DAHP zu 3-Dehydroquinat (3DHQ) in LC100 geschwindigkeitsbestimmend war. Die Überexpression von aroK in LC100 (Erzeugung von LC199) erhöhte die Wachstumsrate leicht (ergänzende Abbildung 10b, d). Der Stamm LC168 zeigte im Vergleich zu LC224 keine Verbesserung (ergänzende Abbildung 10c, e).

Um zu untersuchen, ob die Überexpression von aroB allein zu einer besseren Stammleistung führen kann, haben wir aroB in QP328 überexprimiert und so den Stamm LC349 erzeugt. In der Plattenlesegerät-Auswertung der Stämme LC349, QP328 und LC224 zeigte LC349 die höchste Wachstumsrate auf Glucose und eine etwas geringere Wachstumsrate auf einer Mischung aus Glucose und . 11a–c), wahrscheinlich aufgrund des Fehlens von Mutationen in xylE. Interessanterweise übertraf LC349 in Schüttelkolbenexperimenten mit einer Mischung aus Glucose und Xylose QP328 mit einer viel höheren Muconatausbeute, die immer noch deutlich niedriger war als die von LC224 (ergänzende Abbildung 11d – f). Die Muconatproduktion von LC349 ist langsamer als die von LC224, da es bei LC349 bis zu 41 Stunden und bei LC224 26,5 Stunden dauerte, um den maximalen Muconattiter zu erreichen (ergänzende Abbildung 11e, f).

Als nächstes untersuchten wir die Leistung von LC224 auf M9-Medium, das Glucose, Xylose oder eine Mischung aus beiden enthielt. Die Muconatausbeuten waren bei Xylose am höchsten, bei Glucose am niedrigsten und bei der Mischung im mittleren Bereich (Abb. 4g – i), was den Vorteil der Einführung von Xylose in den Pentosephosphatweg zur Bereitstellung von E4P widerspiegelt. Interessanterweise waren sowohl die Glukose- als auch die Xylose-Verwertungsrate bei der Mischung aus Glukose und Xylose höher als bei Glukose oder Xylose allein (Abb. 4g – i).

Bioreaktorkultivierungen von LC224 und QP478 wurden im Fed-Batch-Modus durchgeführt, um die Zuckerkonzentrationen (Glucose und Xylose) unter 10 g L−1 zu halten (ergänzende Abbildung 12a – c). Glucose und Xylose wurden in beiden Stämmen von Beginn der Kultivierung an gleichzeitig verwendet (Abb. 5a, b); Allerdings waren die Zuckerverwertungsraten bei LC224 höher als bei QP478. LC224 verbrauchte am Ende der Kultivierung 46 g L-1 Glucose und 20 g L-1 Xylose, während QP478 34 g L-1 bzw. 10 g L-1 verbrauchte. Der Muconat-Titer war in LC224 im Vergleich zu QP478 fast dreimal höher, nämlich 26,8 g L−1 bzw. 9,3 g L−1 (Abb. 5a, b). Die Muconat-Ausbeuten erreichten 50 % (molare Ausbeute) in LC224, während die Ausbeuten in QP478 25,9 % betrugen (Abb. 5a, b). Diese Verbesserungen bei LC224 spiegelten sich auch in der gesamten Muconat-Produktionsrate (0,28 g L-1 h-1) wider, die wesentlich höher war als die bei QP478 erreichte (0,10 g L-1 h-1) (Abb. 5a, b). .

a, b Bakterienwachstum, Glukose- und c Bakterienwachstum, Glucose- und Xylose-Verwertung sowie Muconat-Titer, Ausbeuten und Rate von LC224 in 191-stündiger Kultivierung. Für a und b stellen die Datenpunkte die Durchschnittswerte biologischer Duplikate dar, Fehlerbalken stellen die absolute Differenz zwischen den aus Duplikaten zu jedem Zeitpunkt generierten Daten dar; Für (c) stellen Datenpunkte die Werte von Singuletts dar. Die Stoffwechselausbeuten (Mol-%) zu jedem Zeitpunkt wurden als Menge an produziertem Muconat (in Mol) dividiert durch die verwendete Glucose und Xylose (in Mol) berechnet. Die Stoffwechselausbeuten (Mol-%) werden basierend auf dem Verdünnungsfaktor korrigiert, der durch die Volumina der Basen- und Substratzufuhr erzeugt wird. Die aufgeführten endgültigen Kohlenstoffausbeuten (Kohlenstoff-%) wurden als [mM Muconat × 6/mM (Glucose × 6 + Xylose × 5) × 100] berechnet. Die Raten (g L−1 h−1) zu jedem Zeitpunkt wurden als Muconatkonzentration dividiert durch die Kultivierungszeit berechnet. Alle aufgeführten Werte für Titer (T), Rate (R) und Ausbeute (Y) beziehen sich auf den letzten Zeitpunkt. Die in (c) aufgeführten Endausbeuten (Mol-%, Kohlenstoff-%) wurden ebenfalls basierend auf dem quantifizierten verdampften Volumen korrigiert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der bei Bioreaktorkultivierungen erreichte Muconat-Titer, die Rate und die Ausbeute betrugen 26,8 g L−1, 0,28 g L−1 h−1 bzw. 49,9 % (Abb. 5b) nach 96,6 Stunden. Diese Ausbeute stellt fast 100 % des maximalen theoretischen Werts dar, basierend auf unserem Stammdesign und unserer Stoffwechselmodellierung (siehe oben). Um herauszufinden, ob der Titer weiter verbessert werden könnte, führten wir ein weiteres Bioreaktorexperiment durch, bei dem LC224 191 Stunden lang kultiviert wurde (Abb. 5c). Der resultierende Muconat-Titer stieg auf 33,7 g L−1 und erreichte eine Ausbeute von 46 %, 92 % des theoretischen Maximums, korrigiert um die Verdunstung. Es ist auch bemerkenswert, dass LC224 zwar nach etwa 54 Stunden die stationäre Phase erreichte, die Zellen jedoch weiterhin Zucker verwendeten und Muconat produzierten, was zeigte, dass die Muconatproduktion hier nicht wachstumsgekoppelt war, was darauf hindeutet, dass der Muconattiter und die Ausbeute durch das Experiment weiter verbessert werden könnten fortgesetzt hatte (Abb. 5b, c).

Um die Unterschiede zwischen dem nicht weiterentwickelten Elternstamm QP328, dem weiterentwickelten Stamm QP478 und dem rational konstruierten Stamm LC224 besser zu verstehen, wurden intrazelluläre und extrazelluläre Metabolomics-Experimente durchgeführt. Ausgewählte Metaboliten im Zusammenhang mit dem Zuckerstoffwechsel und der Muconatproduktion sind in Abb. 6 dargestellt. Im Vergleich zu QP328 zeigten die Stämme QP478 und LC224 eine geringere Akkumulation von Metaboliten im EDEMP-Zyklus und eine größere Akkumulation von Metaboliten im Shikimat- und Muconatweg (Abb. 6a, b), was mit den Mutationen übereinstimmt, die sich in QP478 entwickelten und in LC224 manipuliert wurden (Abb. 2 und 4). Die Intensitäten von DAHP, dem gemeinsamen Knotenpunkt des Zuckerstoffwechsels und des Shikimat-Weges, zeigten jedoch das entgegengesetzte Muster im Vergleich zu anderen Metaboliten im Shikimat-Weg (Abb. 6b). LC224 und QP478 akkumulierten im Vergleich zu QP328 weniger DAHP, was mit unserem oben genannten Ziel hinsichtlich der Duplikation und der aroB-Überexpression übereinstimmt.

ein vereinfachter Stoffwechselweg. Metaboliten im EDEMP-Zyklus sind blau markiert, im Shikimat- und Muconat-Weg sind grün markiert, der Gelenkknoten DAHP ist lila markiert, die extrazelluläre Anthranilsäure (ANA) ist braun markiert. QA Chinasäure, ANA Anthranilsäure. b Intensität ausgewählter Metaboliten in den drei Stämmen QP328 (blau), QP478 (orange) und LC224 (rot). Die intrazellulären Intensitäten wurden durch lyophilisierte Biomasse normalisiert. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Insbesondere war der DAHP-Spiegel in LC224 im Vergleich zu QP478 viel niedriger, was darauf hindeuten könnte, dass die durch den Tac-Promotor gesteuerte aroB-Aktivität in LC224 höher war als die von QP478. Mit Ausnahme von DAHP akkumulierte LC224 im Vergleich zu QP478 eine höhere Menge an Metaboliten im Shikimat-Weg und weniger Metaboliten im EDEMP-Zyklus (Abb. 6a, b), was darauf hindeutet, dass in LC224 ein größerer Fluss in den Shikimat-Weg eindringt und eine stärkere Muconat-Biosynthese ermöglicht wird.

Obwohl sein Vorläufer 3DHQ in keiner Probe nachgewiesen wurde, wurde Chinasäure (Quinat, QA) im Wesentlichen in LC224 angereichert (Abb. 6b), was auf einen Kohlenstoffüberlauf aufgrund einer Überexpression von aroB schließen lässt. Die Akkumulation von Shikiminsäure (Shikimat, SA) in LC224 ist ein Beweis für die Muconat-Biosynthese über den aroE-Weg, während die SA-Akkumulation in QP478 im Vergleich zu LC224 viel geringer war, was möglicherweise mit der aroK-Duplikation in QP478 zusammenhängt. Die Anreicherung von Anthranilsäure im Kulturmedium stellt wahrscheinlich einen weiteren Fall eines Überlaufstoffwechsels dar. In LC224 sammelte sich mehr Catechol (CAT) an (Abb. 6b), was neue Engpässe im Zusammenhang mit einem erhöhten Fluss zu Muconat darstellen könnte. Zusammengenommen veranschaulichen diese Ergebnisse, dass die Technik zur Erzeugung von LC224 den entwickelten Stamm QP478 im Großen und Ganzen rekapitulierte, und legen zusätzliche Ziele für eine weitere Verbesserung nahe.

Es werden Technologien zur Herstellung nachhaltiger biobasierter Chemikalien benötigt, um die etablierten Petrochemikalien zu ersetzen. Von entscheidender Bedeutung für dieses Unterfangen ist die Entwicklung von Stämmen zur Umwandlung von lignozellulosehaltigen Zuckern wie Glucose und Xylose in Produkte mit industriell relevantem Titer, Geschwindigkeit und Ausbeute. In dieser Arbeit stieg die maximale theoretische molare Ausbeute an Muconat aus einer Mischung aus Glucose und Xylose von ~40 % mit Glucose allein auf 50 %, wenn der Xylosegehalt in der Mischung zwischen 33 und 40 % (Mol-%) liegt, was a ist relevantes Verhältnis in Lignocellulosehydrolysaten (Abb. 1b, ergänzende Abb. 1). Dies wurde durch die Einführung des D-Xylose-Isomerase-Wegs zur Bereitstellung von E4P und die Wiedereinführung von pgi-1 zur Aktivierung des EDEMP-Zyklus erreicht. ALE wurde verwendet, um zusätzliche Ziele für die Entwicklung eines Stamms zu identifizieren, der letztendlich eine Ausbeute von 46 % bei einer Mischung aus Glucose und Xylose erzielte (Abb. 5c), deutlich mehr als die 35,6 %, die wir zuvor mit einem Stamm erreicht hatten, der nur für die Umwandlung von Glucose entwickelt wurde32.

Während der ALE traten in allen ausgewählten Isolaten Mutationen in xylE auf (Abb. 2a und 3f), die das Wachstum auf Xylose verbesserten. Alle fünf Mutationen liegen in den Transmembrandomänen des Transporters (Abb. 3f). Basierend auf früheren Arbeiten im selben System35 und unseren eigenen Daten, die zeigen, dass der Xylose-Metabolismus im Muconat-produzierenden Stamm QP328 (Abb. 1c und 2b), nicht jedoch im nicht Muconat-produzierenden Analogon LC345 (ergänzende Abb. 2a) gehemmt wurde, Wir vermuten, dass die Mutationen eine Reaktion auf Inhibitoren des Muconat-produzierenden Hintergrundstamms waren. Weitere Untersuchungen zur Identifizierung und Charakterisierung der potenziellen Inhibitoren werden in zukünftigen Arbeiten durchgeführt. Darüber hinaus führte eine erhöhte Expression von PP_2569, einem mutmaßlichen MFS-Transporter, der durch eine G→A-Punktmutation in der Promotorregion ermöglicht wurde, zu einer wesentlich höheren Muconat-Ausbeute und einer geringeren Biomasse-Ausbeute in LC100 (Abb. 2b, c), und eine Metabolomik-Analyse legte nahe, dass a Umleitung des Stoffwechselflusses vom EDEMP-Zyklus zum Shikimat-Weg (Abb. 3a). Die intrazelluläre und extrazelluläre Metabolomanalyse der auf Xylose gezüchteten Stämme LC091 und LC100 deutete darauf hin, dass PP_2569 möglicherweise in der Lage ist, Anthranilsäure zu exportieren, wodurch die intrazelluläre Anreicherung aromatischer Aminosäuren verringert wird, von denen bekannt ist, dass sie native DAHP-Synthasen hemmen. Wir beobachteten auch höhere Intensitäten extrazellulärer Anthranilsäure in den Stämmen QP478 und LC224 im Vergleich zum unentwickelten Stamm QP328 (Abb. 6b). Mechanistische Studien mit PP_2569 können für die weitere Technik von Nutzen sein.

ALE führte auch zu einer Duplizierung der Genomregion von PP_5050–PP_5242. Innerhalb dieser Region haben wir gezeigt, dass eine Überexpression von aroB notwendig ist, um hohe Wachstumsraten auf Xylose in LC224 zu erreichen. Im Stamm GB062, einem Stamm, der zuvor für eine verbesserte Umwandlung von Glucose in Muconat durch die Löschung von hexR in CJ5223 entwickelt wurde, deuteten Transkriptomstudien darauf hin, dass die Expression von aroB bereits nach der Löschung von hexR32 erhöht war. In einer anderen Studie, in der P. putida so manipuliert wurde, dass sie PCA aus Glucose produziert, trug die Überexpression von aroB nicht zu einer verbesserten Produktion bei45. Im Stamm LC100, der mit einer Mischung aus Glucose und Xylose kultiviert wurde, schien die AroB-Aktivität jedoch geschwindigkeitsbestimmend zu sein, da die Überexpression von aroB in LC224 das Wachstum und die Muconatproduktion verbesserte (Abb. 4d – i und ergänzende Abb. 10b, c). Dies könnte darauf hindeuten, dass mit dem Eintritt von Xylose in den nichtoxidativen Pentoseweg die Zufuhr von E4P erhöht wurde, was zu einem erhöhten Kohlenstofffluss in den Shikimatweg über die Kondensation von E4P und PEP zu DAHP führte. Der verbesserte DAHP-Spiegel bewirkte, dass die nächste durch AroB katalysierte Reaktion geschwindigkeitsbegrenzend wirkte, wo dies vorher nicht der Fall war. Insgesamt könnte die hier gezeigte technische Strategie zur Verbesserung des Kohlenstoffflusses in und durch den Shikimat-Weg genutzt werden, um die Produktion anderer Shikimat-abgeleiteter Produkte aus Glucose und Xylose in P. putida zu verbessern.

Unser rational entwickelter Stamm LC224 übertraf das Wachstum des entwickelten Stamms QP478 auf Xylose (Abb. 4d). Ein möglicher Grund könnte die Redundanz, Komplexität und Belastung durch die große Duplizierung in QP478 sein. Solche Duplikationen werden wahrscheinlich durch die Rekombination innerhalb ähnlicher Sequenzen an zwei oder mehr Stellen im Genom ermöglicht, sodass die Duplikation bestimmter Regionen begünstigt oder begrenzt wird, was letztendlich die Fähigkeit der Evolution einschränkt, innerhalb der Laborzeitskalen zu idealen Ergebnissen zu gelangen. Mittels Genom-Engineering können jedoch gezielte Veränderungen vorgenommen werden. Tatsächlich übertraf die Überexpression von aroB allein in LC224 QP478 (Abb. 4d – f und ergänzende Abb. 10a, c), das die gesamte PP_5050–PP_5242-Duplikation enthält. Dies zeigt den Nutzen und die Leistungsfähigkeit von ALE als Werkzeug zur Identifizierung von Zielen für rationales Engineering.

Die Überexpression von aroB verbesserte die Zuckerverwertung von LC224 im Vergleich zu LC100 erheblich (Abb. 2d und 4h). In der Metabolomics-Analyse ist der intrazelluläre DAHP-Spiegel von LC224 niedriger als bei den anderen beiden Stämmen (Abb. 6). Dies könnte darauf hindeuten, dass die DAHP-Akkumulation einen negativen Effekt auf den Zuckerstoffwechsel hat, der durch eine Überexpression von aroB gelindert werden kann. Darüber hinaus führte die alleinige Überexpression von aroB in QP328, die LC349 erzeugte, zu einer etwas geringeren Muconatausbeute im Vergleich zu LC224 bei einer Mischung aus Glucose und Xylose (ergänzende Abbildung 11d – f). Da die Wiederherstellung der G → A-Mutation in PPP_2569 im QP478-Stamm hinsichtlich der Variation der Muconat-Ausbeute keinen vergleichbaren Effekt wie das Reverse Engineering in LC091 hatte (Abb. 2c und ergänzende Abb. 6g, h), könnten diese Ergebnisse zusammen darauf hindeuten, dass aroB Überexpression (aufgrund von Duplikation) und Hochregulierung von PP_2569 haben einen ähnlichen Effekt auf die Verringerung der Rückkopplungshemmung von DAHP-Synthasen, was zu einem verbesserten Fluss in den Muconat-Biosyntheseweg führte.

Die Stoffwechselanalyse unserer gentechnisch veränderten Stämme liefert frühe Einblicke in zukünftige technische Bemühungen zur weiteren Verbesserung der Muconatproduktion, die über das hinausgehen, was wir hier mit LC224 gezeigt haben, was in zukünftigen Studien weiterverfolgt wird. Die Quinatakkumulation durch diesen Stamm (Abb. 6b) könnte einen Ansatz zur Verbesserung seiner Leistung durch Überexpression von aroQ oder Löschung von quiA nahelegen. Was die Akkumulation von Shikimat betrifft, so verbesserte die Überexpression von aroB und aroK die Leistung von LC168 im Vergleich zu LC224, dem äquivalenten Stamm, der aroB allein überexprimierte, nicht (Abb. 4h und ergänzende Abb. 10c, e). Dies kann auf mögliche Engpässe in den nachgelagerten Schritten des Weges hinweisen, insbesondere angesichts des relativ hohen Anteils an extrazellulärer Anthranilsäure (ANA), die von QP478 angesammelt wird (Abb. 6b). Eine unzureichende Umwandlung von Chorismat (CSA) in 4-Hydroxybenzoat (4HB) könnte eine Ursache für die Akkumulation von Anthranilsäure sein. Das für Chorismat-Pyruvat-Lyase kodierende Gen ubiC-C22, das zuvor zur Reduzierung der Produkthemmung entwickelt wurde, wurde in unseren Stämmen durch den relativ schwachen Lac-Promotor gesteuert, und ein möglicher Ansatz zur Beschleunigung der Muconat-Biosynthese über Shikimat in LC224 könnte darin bestehen, aroK während zu überexprimieren Gleichzeitig wird das Expressionsniveau von ubiC-C22 erhöht.

Zuvor durchgeführte technisch-ökonomische Analysen für die Umwandlung von Glucose sowie Glucose- und Pentosezucker3 deuteten darauf hin, dass der Mindestverkaufspreis (MSP) von Muconat mit steigender Ausbeute und Rate erheblich sinken würde. Unser gentechnisch veränderter Stamm GB271 produzierte Muconat aus Glucose mit einer Ausbeute von 36 % und einer Rate von 0,21 g L−1 h−1, was einem MSP von etwa 3 kg−1 nach diesem Modell entspricht32. Hier erreichte LC224 eine Ausbeute von fast 50 % bei 0,28 g L−1 h−1 (Abb. 5b). Dies würde den MSP auf etwa 2,2 kg-1 reduzieren, was nahe dem MSP von 1,96 US-Dollar liegt, der zuvor als kommerziell rentabel vorhergesagt wurde3. Das Modell legt nahe, dass der MSP durch eine Erhöhung der Rate und des Ertrags weiter gesenkt werden kann. Angesichts der Tatsache, dass die molare Ausbeute von 50 % in unserem Stammdesign bereits das theoretische Maximum erreicht, werden weitere Geschwindigkeitssteigerungen der Schlüssel zu MSP-Verbesserungen sein.

Zusammenfassend zeigt diese Arbeit eine wirksame Strategie zur Herstellung von Muconat aus Glucose und Xylose unter Verwendung von P. putida. Angesichts der vielversprechenden Ausbeute und des Titers von Muconat aus Glucose und Xylose könnte unser Stamm LC224 auch einen vielversprechenden Plattformstamm für die Produktion anderer vom Shikimat-Weg abgeleiteter Verbindungen darstellen.

Q5® High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs) wurde für alle Polymerasekettenreaktionen verwendet, gefolgt von einem DpnI-Verdau (New England Biolabs), um bei Bedarf die aus Zellen stammende Plasmid-Matrize zu entfernen. NEBuilder HiFi Assembly Master Mix (New England Biolabs) wurde für die Plasmidkonstruktion verwendet, gefolgt von der Transformation in chemisch kompetente NEB 5-α F'Iq E. coli (New England Biolabs) oder in CopyCutter™ EPI400™ elektrokompetente E. coli zur Vermehrung Plasmidausbeute, alles gemäß Herstellerangaben. Transformanten wurden auf Lysogeny Broth (LB)-Agarplatten (Lennox), ergänzt mit 50 μg mL-1 Kanamycin (Sigma-Aldrich), selektiert und über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Korrekte Konstrukte wurden durch Sanger-Sequenzierung (GENEWIZ, Inc.) bestätigt. Einige Plasmide wurden synthetisiert (Twist Bioscience). Detaillierte Informationen zur Plasmidkonstruktion finden Sie in den Zusatzdaten 2. Sequenzen für synthetisierte Plasmide finden Sie in den Zusatzdaten 3. Die bei der Plasmidkonstruktion verwendeten Oligos sind in den Zusatzdaten 4 aufgeführt.

Gendeletionen, -insertionen und -ersetzungen wurden unter Verwendung des Kanamycin-resistenten Gens nptII als Selektionsmarker für die erste Runde der homologen Rekombination des Plasmids in das Chromosom und des Saccharose-sensitiven Gens sacB als Gegenselektionsmarker für die zweite Runde der homologen Gene durchgeführt Rekombination aus dem Chromosom52. Korrekte Gendeletionen, -insertionen und -ersetzungen wurden durch diagnostisches Kolonie-PCR-Produkt basierend auf Unterschieden in der Produktgröße oder im Vorhandensein unter Verwendung von MyTaqTM Red Mix (Bioline) identifiziert. Für Punktmutationseinfügungen und -wiederherstellungen wurden korrekte Ersetzungen überprüft, indem die Intensität der Banden der Kolonie-PCR-Produkte unter Verwendung von Primern verglichen wurde, deren 3'-Nukleotid an das mutierte Nukleotid angelagert war, gefolgt von einer Bestätigung durch Sanger-Sequenzierung.

Plasmide wurden entweder durch Elektroporation oder Konjugation in P. putida transformiert. Für die Elektroporation wurden P. putida-Stämme aus einer Glycerin-Stammlösung in LB-Medium inokuliert und über Nacht bei 30 °C und 225 U/min kultiviert. Elektrokompetente Zellen wurden durch Zentrifugieren von 2,5 ml Übernachtkultur und dreimaliges Waschen in 300 mM Saccharose hergestellt, gefolgt von der Resuspendierung der Zellen in 50 μl 300 mM Saccharose53. Plasmide für die Elektroporation wurden unter Verwendung des Grundplasmids pK18sB54 konstruiert und in einer 0,1-cm-Küvette unter Verwendung eines Gene Pulser Xcell (Bio-Rad) mit der Einstellung 1,6 kV, 25 μF, 200 Ohm elektroporiert. Der gesamte Prozess wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Zur Konjugation wurden Plasmide basierend auf dem Rückgratplasmid pK18msB, das das R4P-oriT enthält, erstellt und von Spender-E.-coli-S17-1-Zellen55 auf die Empfänger-P.-putida-Stämme übertragen. Der plasmidhaltige Spenderstamm E. coli S17-1 wurde in LB-Medium, ergänzt mit 50 μg mL−1 Kanamycin, inokuliert und in einem Schüttelinkubator bei 37 °C und 225 U/min über Nacht kultiviert; Der Empfängerstamm P. putida wurde in LB-Medium inokuliert und in einem Schüttelinkubator über Nacht bei 30 °C und 225 U/min kultiviert. Anschließend wurden über Nacht 1 ml Spender- und Empfängerzellen 2 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert und zweimal mit LB-Medium gewaschen, dann wurden die Pellets resuspendiert und jeweils 400 µL in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemischt und erneut zentrifugiert. Die gemischten Pellets wurden mit 50 µL LB-Medium resuspendiert und auf eine LB-Platte mit zwei Antibiotika in niedriger Konzentration getropft: 10 µg mL-1 Chloramphenicol zur Hemmung des Zellwachstums von E. coli S17-1 und 5 µg mL-1 Kanamycin zur Hemmung Zellwachstum von P. putida. Die Platte wurde 6–10 Stunden lang bei 30 °C inkubiert, um die Konjugation zu ermöglichen. Anschließend wurden die Zellen nach einzelnen Kolonien auf derselben Platte ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Einzelne Kolonien auf der LB-Platte, die Antibiotika in geringer Konzentration enthielten, wurden auf eine neue LB-Platte mit 100 μg mL-1 Chloramphenicol, gegen das P. putida von Natur aus resistent ist, und 50 μg mL-1 Kanamycin erneut ausgestrichen, um sie auf Transkonjuganten zu selektieren. Alle in dieser Studie verwendeten Stämme sind in Tabelle 1 beschrieben. Detaillierte Informationen zur Stammkonstruktion finden Sie in den Zusatzdaten 5.

For shake flask and growth curve experiments, seed cultures were inoculated from glycerol stocks into 14-mL round bottom Falcon® tubes containing 5 mL of LB Miller medium and incubated overnight at 30 °C and 225 rpm. Overnight cultures were then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 10 mL LB medium to an initial OD600 of 0.2. These second seed cultures were cultivated at 30 °C at 225 rpm for 4 h to reach an OD600 of ~2. The second seed cultures were washed twice with M9 salts (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl) and then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 25 mL modified M9 minimal medium (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl, 2 mM MgSO4, 100 µM CaCl2, 18 µM FeSO4) supplemented with either 30 mM xylose, 30 mM glucose, or mixture of 30 mM glucose and 15 mM xylose, to an initial OD600 of 0.1. The molar ratio of glucose and xylose in mixed substrates is 2:1, which is the ratio typical of corn stover hydrolysates10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3149"> 56. Alle Wachstumskurven wurden auf Bioscreen C Pro-Analysegeräten (Growth Curves US) unter Verwendung von 300-µL-Kulturen charakterisiert, die wie oben für die Schüttelkolben beschrieben beimpft wurden. Schüttelkolben- und Plattenlesegerätdaten wurden mit GraphPad Prism Version 8.4.2 aufgezeichnet und analysiert. Die absolute Wachstumsrate (μA) und die Wachstumsverzögerung (λ) wurden auf der Grundlage der Gompertz-Gleichung unter Verwendung der Standardeinstellungen des in GitHub hinterlegten FittR-Tools berechnet (https://github.com/scott-saunders/growth_curve_fitting)57. In einigen Fällen wurde die Sterbephase aus der Wachstumskurve entfernt, um sie an das Modell anzupassen.

Die pH-Werte der Kolben wurden zu jedem Probenahmezeitpunkt mit einem Mini-pH-Meter (HORIBA LAQUAtwin pH-33) überwacht und bei Bedarf wurde 1 N NaOH verwendet, um den pH-Wert auf 7 einzustellen. Für Experimente mit Schüttelkolben wurden die Ausbeuten berechnet zu dem Zeitpunkt, an dem die maximale Muconatkonzentration festgestellt wurde.

Ein Kern-Kohlenstoff-Stoffwechselmodell von P. putida3, das die in Abb. 1a gezeigte Reaktion berücksichtigt, wurde um Reaktionen aus der aroE-Syntheseroute erweitert, wobei eine Stöchiometrie verwendet wurde, die an ein Genommodell von P. putida KT244058 angepasst wurde. Die Ausbeuteberechnungen wurden unter der Annahme durchgeführt, dass keine ATP-Erhaltung erforderlich ist, indem der Muconatfluss optimiert und gleichzeitig der Xyloseanteil im Medium variiert wurde. Berechnungen wurden mit der Cobrapy-Bibliothek (Version 0.22.1) in Python 3.8.1059 durchgeführt.

Um ALE durchzuführen, wurde der Stamm QP328 zunächst in LB-Miller-Medium aus einer Glycerin-Stammlösung inokuliert und über Nacht als Impfkultur gezüchtet. Zellen aus der Übernachtkultur wurden dann zweimal mit M9-Salzen gewaschen und in M9-Salzen resuspendiert. Die gewaschenen Zellen wurden in einem Kulturröhrchen mit 5 ml M9-Medium und 10 mM Xylose als einziger Kohlenstoffquelle auf eine anfängliche OD600 von 0,1 beimpft und bei 30 °C unter Schütteln bei 225 U/min kultiviert. Eine serielle Passage wurde durchgeführt, indem 1 % (v/v) der Kultur in frisches Medium überführt wurde, sobald Wachstum beobachtet wurde, was zunächst etwa zwei Wochen der Kultivierung in Anspruch nahm. Die Anzahl der Generationen wurde basierend auf dem OD600-Wert gemäß Gl. berechnet. (1):32

Anfangs-, periodische Zwischen- und Endpopulationen wurden als Glycerinvorräte konserviert.

cis,cis- und cis,trans-Muconsäure-Isomere wurden analysiert, indem ein einzigartiger Standard an cis,trans-Muconsäure hergestellt wurde, um eine genaue Quantifizierung beider Muconsäure-Isomere zu erreichen60. Trennung und Nachweis wurden unter Verwendung der folgenden chromatographischen Bedingungen erreicht. Proben und Standards wurden mit einem Agilent UHPLC der Serie 1290 (Agilent Technologies) analysiert, gekoppelt mit einem Diodenarray-Detektor (DAD) und einer Phenomenex Luna C18(2)-HST-Säule 2,5 μm, 2 × 100 mm. Ein Injektionsvolumen von 1 μL wurde auf die Säule injiziert, in der die Temperatur konstant bei 45 °C gehalten wurde. Muconsäure-Isomere wurden bei der Wellenlänge 265 nm mit einem Quantifizierungsbereich von 1 ppm bis 500 ppm überwacht und quantifiziert. Ein Gradient von 0,16 % Ameisensäure in Wasser (A) und Acetonitril (B) wurde mit einer Flussrate von 0,5 ml/min verwendet. Die chromatographische Trennung der Analyten wurde mit dem folgenden Gradientenprogramm erreicht: Anfang (t0) bis t = 1 Minute: A-100 % und B-0 %; Anstieg auf A-50 % und B-50 % von t = 1–7,67 min; Anstieg auf A-30 % und B-70 % von t = 7,67–9,33 Min. und gehalten bis 10,67 Min. Bei 10,68 Minuten wurde der Gradient auf A-100 % und B-0 % zurückgeführt und für eine Gesamtlaufzeit von 13 Minuten isokratisch gehalten. Alle 10–15 Proben wurde ein Kalibrierungsüberprüfungsstandard durchgeführt, um die Stabilität des Detektors sicherzustellen. Glucose wurde durch HPLC mit Brechungsindexdetektion gekoppelt mit einer Aminex HPX-87H-Säule (Bio-Rad)61 quantifiziert, während Xylose auf ähnliche Weise und gleichzeitig quantifiziert wurde. Reine Standards wurden von Sigma-Aldrich bezogen.

Für die quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (RT-qPCR) von PP_2569 in den Stämmen LC091 und LC100 wurden die Zellen in Schüttelkolben mit M9 und 30 mM Xylose gemäß dem oben genannten Schüttelkolbenprotokoll kultiviert. Für die RT-qPCR von PP_4302 in den Stämmen LC100 und LC224 wurden die Zellen in Schüttelkolben mit LB-Medium kultiviert. Die Zellen wurden in der mittleren Log-Phase geerntet und mit TRI®-Reagenz (Sigma, T9424) aufgebrochen, gefolgt von einer RNA-Miniprep mit dem Direct-zolTM RNA-Miniprep-Kit (Zymo Research, R2052) gemäß dem Protokoll. Die extrahierten Gesamt-RNAs wurden dann mit DNase I (Zymo Research, E1009-A) verdaut und mit dem RNA Clean & ConcentratorTM-5 Kit (Zymo Research, R1014) gereinigt. Die RNA-Konzentrationen wurden mit NanoDropTM one (Thermo Scientific) bei 260 nm bestimmt. 500 ng Gesamt-RNA jeder Probe wurden für die Reverse Transkription hinzugefügt, wobei der iScript™ Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad) zur Synthese von cDNA verwendet wurde. RT-qPCR wurde mit KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) und dem 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) durchgeführt.

Das Housekeeping-Gen rpoD wurde als Referenzkontrolle zur Normalisierung verschiedener Proben eingesetzt62. Die Primer oLC-0109 und oLC-0110 wurden zur Amplifikation von rpoD verwendet; oLC-0107 und oLC-0108 wurden zur Verstärkung von PP_2569 verwendet; oLC-0353 und oLC-0354 wurden zur Verstärkung von PP_4302 verwendet. Wir verwendeten die 2-ΔΔCt-Methode, um die Transkriptionsniveaus zwischen Proben zu quantifizieren63.

Um die Stämme QP478 und LC224 in Bioreaktoren zu bewerten, wurden die Stämme aus Glycerinvorräten in 250-ml-Kolben mit Schikanen, die 50 ml LB (Miller) enthielten, inokuliert und 16 Stunden lang bei 30 °C und 225 U/min inkubiert. Die Saatkultivierung wurde für jeden Stamm doppelt durchgeführt und jede Wiederholung wurde zur Beimpfung unabhängiger Bioreaktoren verwendet. Die Zellen wurden zentrifugiert (5000 × g, 10 min), der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 5 ml modifiziertem M9 resuspendiert. Das modifizierte M9 enthielt 13,56 g L−1 Na2HPO4, 6 g L−1 KH2PO4, 1 g L−1 NaCl, 2 g L−1 (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 100 μM CaCl2 und 36 μM FeSO4.

Cells were inoculated in 0.5 L bioreactors (BioStat-Q Plus, Sartorius Stedim Biotech) at an initial OD600 of 0.2. The batch phase consisted of growth on 300 mL of modified M9 with 10.6 g L−1 glucose and 4.4 g L−1 xylose, which mimics the sugar ratio in sugar hydrolysates from corn stover10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3452"> 56. Die Fed-Batch-Phase wurde eingeleitet, als die Zuckerkonzentration etwa 7 g L-1 betrug. Zu diesem Zeitpunkt wurden Zucker verfüttert, um die Zuckerkonzentrationen zwischen etwa 2 und 10 g L-1 aufrechtzuerhalten, indem die Fütterungsraten manuell geändert wurden. Die Fütterungslösung enthielt 353 g L-1 Glucose und 147 g L-1 Xylose und ihr pH-Wert wurde mit NaOH auf pH 7 eingestellt. Der pH-Wert der Bioreaktoren wurde durch Zugabe von 4 N NH4OH bei 30 °C auf 7 eingestellt und Luft wurde mit 1 vvm eingeblasen. Die anfängliche Rührgeschwindigkeit in der Batch-Phase betrug 350 U/min. Wenn der gelöste Sauerstoff (DO) einen Wert von 30 % erreichte, wurde er durch automatische Rühranpassungen automatisch auf diesem Niveau geregelt. In regelmäßigen Abständen wurden Proben entnommen, um das Bakterienwachstum zu bewerten und die Zuckerkonzentrationen und Muconat zu analysieren.

Zellpellets und Überstandsproben wurden getrennt durch Zentrifugation von 1 ml Schüttelkolbenkulturen gesammelt, die auf einer Mischung aus Glucose und Xylose in der mittleren logarithmischen Phase (OD600 ~ 1,0) gezüchtet wurden, und die Proben wurden bis zur Analyse bei –80 °C eingefroren . Zellpellets wurden lyophilisiert und die intrazellulären Metaboliten wurden aus 3 mg getrockneter Biomasse mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser64 extrahiert, und sowohl die wässrige als auch die organische Schicht wurden in ein neues Fläschchen überführt und vollständig getrocknet. Die extrazellulären Metaboliten wurden durch Trocknen der überstehenden Proben unter Vakuum vor der Analyse hergestellt. Die Metaboliten wurden auf Grundlage der unten aufgeführten Methode65 chemisch derivatisiert. Um Carbonylgruppen zu schützen und die Bildung tautomerer Isomere zu verringern, wurde jedem getrockneten Extrakt eine Lösung von Methoxyamin (20 µL einer 30-mg-ml-1-Stammlösung in Pyridin) zugesetzt. Anschließend wurden die Proben 90 Minuten lang unter Schütteln bei 37 °C inkubiert. Um saure Protonen in Hydroxyl-, Amino- und Carboxylgruppen zu entfernen, wurde eine Trimethylsilylierungsreaktion verwendet, wobei jedem Fläschchen N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid mit 1 % Trimethylchlorsilan (80 µL) zugesetzt wurde. Die Proben wurden erneut 30 Minuten lang bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurden die Fläschchen zentrifugiert und die Flüssigkeit in einen kleinvolumigen Glaseinsatz überführt. Die Proben wurden mit einem Gaschromatographie-Massenspektrometer (GC-MS) unter Verwendung einer HP-5MS-Säule (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm; Agilent Technologies) für ungezielte Analysen analysiert. Von jeder Probe wurde im Splitless-Modus ein Volumen von 1 µL injiziert und die Heliumgasdurchflussrate mithilfe der Retention Time Locking-Funktion basierend auf der Elutionszeit deuterierter Myristinsäure (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ermittelt. Die Temperatur der Einspritzöffnung wurde während der gesamten Analyse auf 250 °C gehalten. Der GC-Ofengradient begann mit einer Temperatur von 60 °C, die nach der Injektion 1 Minute lang gehalten wurde, gefolgt von einem Anstieg auf 325 °C mit einer Geschwindigkeit von 10 °C pro Minute und endete mit einem 10-minütigen Halten bei 325 °C. Die Sammlung von MS-Daten deckte den Massenbereich 50–600 m/z ab. Neben jeder Probencharge wurde eine Mischung aus Fettsäuremethylestern (FAMEs, C8-C28) analysiert, um in der anschließenden Datenanalyse einen Retentionsindex-Abgleich durchführen zu können. GC-MS-Datendateien wurden in das CDF-Format konvertiert und mit der Software Metabolite Detector 2.566 entfaltet und ausgerichtet. Die Identifizierung von Metaboliten erfolgte durch Abgleich mit PNNL-Metabolomics-Datenbanken – einer erweiterten Version der Fiehn-Datenbank67. Diese Datenbank enthält Massenspektren und Retentionsindexinformationen von über 1000 authentischen chemischen Standards und wurde mit kommerziellen GC-MS-Datenbanken wie der NIST20-Spektralbibliothek und den GC-MS-Datenbanken der 11. Version von Wiley68,69 abgeglichen. Drei einzigartige Fragmentionen wurden ausgewählt und zur Integration der Peakflächenwerte verwendet, und einige Metaboliten wurden bei Bedarf manuell kuratiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Daten zur Sequenzierung des gesamten Genoms, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, wurden in der NCBI SRA-Datenbank mit der Zugangsnummer PRJNA783062 hinterlegt. Auf PP_2569 kann in der Uniprot-Datenbank über den Link https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q88JS8/entry zugegriffen werden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Choi, S., Song, CW, Shin, JH & Lee, SY Bioraffinerien zur Herstellung erstklassiger Grundchemikalien und ihrer Derivate. Metab. Ing. 28, 223–239 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chundawat, SP, Beckham, GT, Himmel, ME & Dale, BE Dekonstruktion von Lignozellulose-Biomasse zu Kraftstoffen und Chemikalien. Annu. Rev. Chem. Biomol. Ing. 2, 121–145 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Johnson, CW et al. Innovative Chemikalien und Materialien aus bakteriellen aromatischen Katabolwegen. Joule 3, 1523–1537 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Fuchs, G., Boll, M. & Heider, J. Mikrobieller Abbau aromatischer Verbindungen – von einer Strategie auf vier. Nat. Rev. Microbiol. 9, 803–816 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Draths, KM & Frost, JW Umweltverträgliche Synthese von Adipinsäure aus D-Glucose. Marmelade. Chem. Soc. 116, 399–400 (1994).

Artikel CAS Google Scholar

Khalil, I., Quintens, G., Junkers, T. & Dusselier, M. Muconsäureisomere als Plattformchemikalien und Monomere in der biobasierten Wirtschaft. Grün. Chem. 22, 1517–1541 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Salvachúa, D. et al. Bioprozessentwicklung zur Herstellung von Muconsäure aus aromatischen Verbindungen und Lignin. Grün. Chem. 20, 5007–5019 (2018).

Artikel Google Scholar

Suastegui, M. et al. Kombination von Metabolic Engineering und Elektrokatalyse: Anwendung zur Herstellung von Polyamiden aus Zucker. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 55, 2368–2373 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vardon, DR et al. Adipinsäureproduktion aus Lignin. Energieumwelt. Wissenschaft. 8, 617–628 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Xie, NZ, Liang, H., Huang, RB & Xu, P. Biotechnologische Produktion von Muconsäure: aktueller Stand und Zukunftsaussichten. Biotechnologie. Adv. 32, 615–622 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fujiwara, R., Noda, S., Tanaka, T. & Kondo, A. Metabolic Engineering von Escherichia coli für die Produktion von Shikimat-Signalweg-Derivaten aus Glucose-Xylose-Cosubstrat. Nat. Komm. 11, 279 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, HT et al. Biologische Verwertung von Poly(ethylenterephthalat)-Monomeren für das Upcycling von PET-Abfällen. ACS Sustain. Chem. Ing. 7, 19396–19406 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Shanks, BH & Keeling, PL Bioprivilegierte Moleküle: Wertschöpfung aus Biomasse. Grün. Chem. 19, 3177–3185 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Lu, R. et al. Herstellung von Diethylterephthalat aus aus Biomasse gewonnener Muconsäure. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 55, 249–253 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vardon, DR et al. Cis,cis-Muconsäure: Trennung und Katalyse zu Bioadipinsäure für die Nylon-6,6-Polymerisation. Grün. Chem. 18, 3397–3413 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Abdolmohammadi, S., Hernández, N., Tessonnier, J.-P. & Cochran, EW Biologisch vorteilhaftes Nylon aus erneuerbarer Muconsäure: Synthese, Charakterisierung und Eigenschaften. in Green Polymer Chemistry: New Products, Processes, and Applications (Hrsg. Cheng, HN, Gross, RA, & Smith, PB) 355–367 (American Chemical Society, 2018).

Carraher, JM, Pfennig, T., Rao, RG, Shanks, BH & Tessonnier, J.-P. Cis,cis-Muconsäure-Isomerisierung und katalytische Umwandlung in biobasierte cyclische C6-1,4-Disäure-Monomere. Grün. Chem. 19, 3042–3050 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Carraher, JM et al. Lösungsmittelgesteuerte Isomerisierung von cis,cis-Muconsäure zur Herstellung spezieller und leistungsvorteilhafter zyklischer biobasierter Monomere. Grün. Chem. 22, 6444–6454 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Cywar, RM, Rorrer, NA, Hoyt, CB, Beckham, GT & Chen, EYX Biobasierte Polymere mit leistungssteigernden Eigenschaften. Nat. Rev. Mater. 7, 83–103 (2021).

Fitzgerald, N. & Bailey, A. Workshop-Bericht über leistungssteigernde biobasierte Chemikalien. BETO Rep. Einführung, 1–3 (2018).

Matthiesen, JE, Carraher, JM, Vasiliu, M., Dixon, DA & Tessonnier, J.-P. Elektrochemische Umwandlung von Muconsäure in biobasierte Disäuremonomere. ACS Sustain. Chem. Ing. 4, 3575–3585 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Rorrer, NA et al. Erneuerbare ungesättigte Polyester aus Muconsäure. ACS Sustain. Chem. Ing. 4, 6867–6876 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Rorrer, NA, Vardon, DR, Dorgan, JR, Gjersing, EJ & Beckham, GT Aus Biomasse gewonnene Monomere für leistungsdifferenzierte faserverstärkte Polymerverbundwerkstoffe. Grün. Chem. 19, 2812–2825 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Rorrer, NA et al. Die Kombination von recyceltem PET mit biobasierten Monomeren ermöglicht das Upcycling von Kunststoffen. Joule 3, 1006–1027 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Thompson, B., Pugh, S., Machas, M. & Nielsen, DR Muconsäureproduktion über alternative Wege und einen synthetischen „Stoffwechseltrichter“. ACS Synth. Biol. 7, 565–575 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lin, Y., Sun, X., Yuan, Q. & Yan, Y. Erweiterung des Shikimat-Weges zur Produktion von Muconsäure und ihrer Vorstufe Salicylsäure in Escherichia coli. Metab. Ing. 23, 62–69 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sun, Appl. Umgebung. Mikrobiol. 79, 4024–4030 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, X., Lin, Y., Yuan, Q. & Yan, Y. Biologische Produktion von Muconsäure über eine prokaryotische 2,3-Dihydroxybenzoesäure-Decarboxylase. ChemSusChem 7, 2478–2481 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Averesch, NJH & Kromer, JO Maßgeschneiderte Stammkonstruktionsstrategien für die Muconsäureproduktion in S. cerevisiae und E. coli. Metab. Ing. Komm. 1, 19–28 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Averesch, NJH & Krömer, JO Metabolisches Engineering des Shikimat-Weges zur Produktion von Aromaten und abgeleiteten Verbindungen – gegenwärtige und zukünftige Strategien zum Aufbau von Stämmen. Vorderseite. Bioeng. Biotechnologie. 6, 32 (2018).

Lee, HN et al. Design einer Corynebacterium-Zellfabrik und Optimierung des Kulturprozesses für die Muconsäure-Biosynthese. Wissenschaft. Rep. 8, 18041 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bentley, GJ et al. Manipulation des Glukosestoffwechsels zur Steigerung der Muconsäureproduktion in Pseudomonas putida KT2440. Metab. Ing. 59, 64–75 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Johnson, CW et al. Steigerung der Muconsäureproduktion aus Glucose und Lignin-abgeleiteten aromatischen Verbindungen durch erhöhte Protocatechuat-Decarboxylase-Aktivität. Metab. Ing. Komm. 3, 111–119 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Dvorak, P. & de Lorenzo, V. Umgestaltung des oberen Zuckerstoffwechsels von Pseudomonas putida zur gemeinsamen Nutzung von Cellobiose, Xylose und Glucose. Metab. Ing. 48, 94–108 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Elmore, JR et al. Gentechnisch veränderter Pseudomonas putida katabolisiert gleichzeitig fünf Hauptbestandteile der Maisstroh-Lignozellulose: Glucose, Xylose, Arabinose, p-Cumarsäure und Essigsäure. Metab. Ing. 62, 62–71 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bator, I., Wittgens, A., Rosenau, F., Tiso, T. & Blank, LM Vergleich von drei Xylose-Wegen in Pseudomonas putida KT2440 für die Synthese wertvoller Produkte. Vorderseite. Bioeng. Biotechnologie. 7, 480 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Lim, HG et al. Erzeugung von Pseudomonas putida KT2440-Stämmen mit effizienter Nutzung von Xylose und Galactose durch adaptive Laborevolution. ACS Sustainable Chem. Ing. 9, 11512–11523 (2021).

Meijnen, JP, de Winde, JH & Ruijssenaars, HJ Stoffwechsel- und regulatorische Umlagerungen, die einer effizienten D-Xylose-Nutzung in manipuliertem Pseudomonas putida S12 zugrunde liegen. J. Biol. Chem. 287, 14606–14614 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weimberg, R. Pentoseoxidation durch Pseudomonas fragi. J. Biol. Chem. 236, 629–635 (1961).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dahms, AS 3-Desoxy-D-pentulosonsäurealdolase und ihre Rolle in einem neuen Weg des D-Xylose-Abbaus. Biochem. Biophys. Res. Komm. 60, 1433–1439 (1974).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jha, RK et al. Sensorgestützte Linderung der Produkthemmung in der Chorismatpyruvat-Lyase. Acs. Synth. Biol. 8, 775–786 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nikel, PI, Chavarria, M., Fuhrer, T., Sauer, U. & de Lorenzo, V. Der Stamm Pseudomonas putida KT2440 metabolisiert Glukose über einen Zyklus, der aus Enzymen des Entner-Doudoroff-, Embden-Meyerhof-Parnas- und Pentose-Enzyms besteht Phosphatwege. J. Biol. Chem. 290, 25920–25932 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Salamov, VSA & Solovyevand, A. Automatische Annotation mikrobieller Genome und metagenomischer Sequenzen. in Metagenomik und ihren Anwendungen in Landwirtschaft, Biomedizin und Umweltstudien (Hrsg. Li, RW) 61–78 (Hauppauge: Nova Science Publishers, 2011).

Whitaker, RJ, Fiske, MJ & Jensen, RA Pseudomonas aeruginosa besitzt zwei neuartige regulatorische Isozyme der 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase. J. Biol. Chem. 257, 12789–12794 (1982).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, J. & Ye, BC Stoffwechsel-Engineering von Pseudomonas putida KT2440 für die Produktion von Protocatechinsäure mit hoher Ausbeute. Bioresour. Technol. 319, 124239 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wynands, B. et al. Stoffwechsel-Engineering von Pseudomonas taiwanensis VLB120 mit minimalen genomischen Modifikationen für eine Phenolproduktion mit hoher Ausbeute. Metab. Ing. 47, 121–133 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Winter, G., Averesch, NJH, Nunez-Bernal, D. & Krömer, JO Die In-vivo-Instabilität von Chorismat führt zu Substratverlusten während der fermentativen Produktion von Aromaten. Yeast 31, 333–341 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sun, L. et al. Kristallstruktur eines bakteriellen Homologen der Glukosetransporter GLUT1-4. Natur 490, 361–366 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Jiang, X. et al. Entwickelte XylE als Werkzeug zur mechanistischen Untersuchung und Ligandenentdeckung der Glukosetransporter GLUTs. Zellentdeckung. 5, 14 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Prodanov, T. & Bansal, V. Sensitives Alignment mit paralogen Sequenzvarianten verbessert die Long-Read-Zuordnung und den Variantenaufruf in segmentalen Duplikationen. Nukleinsäuren Res. 48, e114 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Treangen, TJ & Salzberg, SL Repetitive DNA und Sequenzierung der nächsten Generation: rechnerische Herausforderungen und Lösungen. Nat. Rev. Genet. 13, 36–46 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Johnson, CW & Beckham, GT Auswahl aromatischer Katabolikwege für eine optimale Produktion von Pyruvat und Laktat aus Lignin. Metab. Ing. 28, 240–247 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Choi, KH, Kumar, A. & Schweizer, HP Eine 10-minütige Methode zur Herstellung hochelektrokompetenter Pseudomonas aeruginosa-Zellen: Anwendung für DNA-Fragmenttransfer zwischen Chromosomen und Plasmidtransformation. J. Mikrobiol. Methoden 64, 391–397 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jayakody, LN et al. Thermochemische Abwasseraufwertung durch verbesserte mikrobielle Toxizitätstoleranz. Energieumwelt. Wissenschaft. 11, 1625–1638 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Simon, R., Priefer, U. & Pühler, A. Ein breites Wirtsspektrum-Mobilisierungssystem für die In-vivo-Gentechnik: Transposon-Mutagenese in gramnegativen Bakterien. Bio/Techn. 1, 784–791 (1983).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, X. et al. Durch die DMR-Verarbeitung (Deacetylierung und mechanische Raffinierung) von Maisstroh werden hohe Konzentrationen an Monomerzucker (230 g L−1) während der enzymatischen Hydrolyse und hohe Ethanolkonzentrationen (>10 % v/v) während der Fermentation erreicht, ohne dass das Hydrolysat gereinigt oder konzentriert werden muss. Energieumwelt. Wissenschaft. 9, 1237–1245 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Scott, HS Wachstumskurve FittR (v1.0-beta). Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6360544. (2022).

Nogales, J., Gudmundsson, S., Duque, E., Ramos, JL & Palsson, BO Die Erweiterung des berechenbaren Reaktoms in Pseudomonas putida zeigt Stoffwechselzyklen, die für Robustheit sorgen. Vorabdruck unter https://www.biorxiv.org/content/10.1101/139121v1 (2017).

Ebrahim, A., Lerman, JA, Palsson, BO & Hyduke, DR COBRApy: Constraints-basierte Rekonstruktion und Analyse für Python. BMC-Syst. Bio. 7, 74 (2013).

Artikel Google Scholar

Pleitner, BA, Michener, WE, Payne, CE & Beckham, GT Bestimmung von cis,cis- und cis,trans-Muconsäure aus der biologischen Umwandlung. Golden, CO: Nationales Labor für erneuerbare Energien. NREL/TP-5100-74473. https://www.nrel.gov/docs/fy19osti/74473.pdf (2019).

Notonier, S. et al. Der Stoffwechsel von Syringyllignin-abgeleiteten Verbindungen in Pseudomonas putida ermöglicht die konvergente Produktion von 2-Pyron-4,6-dicarbonsäure. Metab. Ing. 65, 111–122 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, Q. & Nomura, CT Überwachung von Unterschieden im Genexpressionsniveau und der Polyhydroxyalkanoat (PHA)-Produktion in Pseudomonas putida KT2440, das auf verschiedenen Kohlenstoffquellen angebaut wird. J. Biosci. Bioeng. 110, 653–659 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schmittgen, TD & Livak, KJ Analyse von Echtzeit-PCR-Daten mit der vergleichenden CT-Methode. Nat. Protokoll. 3, 1101–1108 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakayasu, ES et al. MPLEx: ein robustes und universelles Protokoll für integrative proteomische, metabolomische und lipidomische Einzelprobenanalysen. mSystems 1, e00043-16 (2016).

Kim, YM et al. Diel-Metabolomics-Analyse einer chlorophototrophen mikrobiellen Matte einer heißen Quelle führt zu neuen Hypothesen über den Stoffwechsel von Gemeinschaftsmitgliedern. Vorderseite. Mikrobiol. 6, 209 (2015).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Hiller, K. et al. MetaboliteDetector: umfassendes Analysetool für gezielte und nicht-zielgerichtete GC/MS-basierte Metabolomanalyse. Anal. Chem. 81, 3429–3439 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kind, T. et al. FiehnLib: Massenspektral- und Retentionsindexbibliotheken für Metabolomik basierend auf Quadrupol- und Flugzeit-Gaschromatographie/Massenspektrometrie. Anal. Chem. 81, 10038–10048 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mao, JH et al. Genetische und metabolische Verbindungen zwischen dem murinen Mikrobiom und dem Gedächtnis. Mikrobiom 8, 53 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharon, G. et al. Menschliche Darmmikrobiota aufgrund einer Autismus-Spektrum-Störung fördern Verhaltenssymptome bei Mäusen. Zelle 177, 1600–1618 e1617 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kikuchi, Y., Tsujimoto, K. & Kurahashi, O. Mutationsanalyse der Rückkopplungsstellen der Phenylalanin-sensitiven 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase von Escherichia coli. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 63, 761–762 (1997).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Diese Arbeit wurde teilweise von Alliance for Sustainable Energy, LLC verfasst, dem Manager und Betreiber des National Renewable Energy Laboratory für das US-Energieministerium (DOE) unter der Vertragsnummer DE-AC36-08GO28308. Diese Arbeit wurde teilweise auch vom Oak Ridge National Laboratory verfasst, das von UT-Battelle, LLC für das US-amerikanische Energieministerium unter dem Vertrag DE-AC05-00OR22725 verwaltet wird. Ein Teil dieser Forschung wurde am Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) unter Verwendung von EMSL (grid.436923.9) durchgeführt, einer Benutzereinrichtung des DOE Office of Science, die vom Office of Biological and Environmental Research gesponsert wird. PNNL ist ein nationales Multiprogramm-Labor, das von Battelle für das Department of Energy (DOE) im Rahmen des Vertrags DE-AC05-76RLO 1830 betrieben wird. Die Finanzierung erfolgte durch das Office of Energy Efficiency and Renewable Energy Bioenergy Technologies Office (BETO) des US-Energieministeriums Agile BioFoundry. Wir danken Stefan Haugen, William Michener, Morgan Ingraham und Kelley Hestmark für ihre Bemühungen in der Analytik. Wir danken Scott Saunders vom University of Texas Southwestern Medical Center für das Wachstumskurvenanpassungstool FittR. Wir danken Eugene Kuatsjah für seine Hilfe bei Pymol. Wir danken Taraka Dale vom Los Alamos National Laboratory für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken Jay Fitzgerald und Gayle Bentley vom DOE, Prof. Eiji Masai von der Nagaoka University of Technology, Kevin McNaught und Mitgliedern der Agile BioFoundry für hilfreiche Diskussionen.

Renewable Resources and Enabling Sciences Center, National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO, 80401, USA

Chen Ling, Davinia Salvachúa, Colin M. Kneucker, Christopher H. Calvey, Michela A. Monninger, Kelsey J. Ramirez, Peter C. St. John, Sean P. Woodworth, Christopher W. Johnson und Gregg T. Beckham

Agile BioFoundry, Emeryville, CA, 94608, USA

Chen Ling, George L. Peabody, Davinia Salvachua, Young-Mo Kim, Colin M. Kneucker, Michela A. Monninger, Nathalie Munoz Munoz, Brenton C. Poirier, Kelsey J. Ramirez, Peter C. St. John, Sean P. Woodworth, Jon K. Magnuson, Kristin E. Burnum-Johnson, Adam M. Guss, Christopher W. Johnson und Gregg T. Beckham

Abteilung für Biowissenschaften, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, 37831, USA

George L. Peabody und Adam M. Guss

Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA, 99352, USA

Young-Mo Kim, Nathalie Munoz Munoz, Brenton C. Poirier, Jon K. Magnuson und Kristin E. Burnum-Johnson

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CL, GLP, AMG, CWJ und GTB entwickelten das Projektkonzept. Von CL, GLP, DS, AMG, CWJ und GTB entworfene Experimente. CL, GLP und CHC führten die Plasmid-DNA-Konstruktion und die Konstruktion des P. putida-Stammes durch. CL, GLP und MAM führten Plattenlese- und Schüttelkolbenexperimente durch. CMK führte Bioreaktorkultivierungen durch. Y.-MK, NMM, BCP, JKM und KEB-J. generierte die Metabolomics-Daten. PSJ führte eine Stoffwechselmodellierung durch. KJR und SPW führten die Quantifizierung der Analyten durch. CL, GLP, DS, CMK und Y.-MK führten eine Datenanalyse durch. CL, DS, AMG, CWJ und GTB haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Adam M. Guss, Christopher W. Johnson oder Gregg T. Beckham.

CL, GTB, CWJ, AMG, GLP und DS sind Erfinder eines vorläufigen US-Patents (Anmeldung Nr. 63/321332), das sich auf die Herstellung von Muconsäure aus lignozellulosehaltigen Zuckern bezieht. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Tsutomu Tanaka und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ling, C., Peabody, GL, Salvachúa, D. et al. Muconsäureproduktion aus Glucose und Xylose in Pseudomonas putida durch Evolution und Metabolic Engineering. Nat Commun 13, 4925 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32296-y

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Eingegangen: 10. November 2021

Angenommen: 25. Juli 2022

Veröffentlicht: 22. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32296-y

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