Eine neuartige Strategie zur Charakterisierung des Musters von β

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9177 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Carbapenem-resistenter Acinetobacter baumannii (CRAb) stellt laut CDC eine dringende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Für diesen Erreger gibt es nur wenige Behandlungsmöglichkeiten und er verursacht schwere nosokomiale Infektionen mit einer Todesrate von > 50 %. Obwohl frühere Studien das Proteom von CRAb untersucht haben, gab es keine gezielten Analysen dynamischer Veränderungen der β-Lactamase-Expression, die aufgrund der Arzneimittelexposition auftreten können. Hier präsentieren wir unsere erste proteomische Studie zur Variation der β-Lactamase-Expression, die in CRAb mit verschiedenen β-Lactam-Antibiotika auftritt. Kurz gesagt, eine Arzneimittelresistenz gegen Ab (ATCC 19606) wurde durch die Verabreichung verschiedener Klassen von β-Lactam-Antibiotika induziert, und der zellfreie Überstand wurde isoliert, konzentriert, durch SDS-PAGE getrennt, mit Trypsin verdaut und durch Markierung identifiziert. kostenlose LC-MS-basierte quantitative Proteomik. Dreizehn Proteine wurden mithilfe einer 1789-Sequenzdatenbank von Ab-β-Lactamasen von UniProt identifiziert und bewertet, von denen die meisten β-Lactamasen der Klasse C waren (≥ 80 %). Wichtig ist, dass verschiedene Antibiotika, sogar solche der gleichen Klasse (z. B. Penicillin und Amoxicillin), nicht äquivalente Reaktionen hervorriefen, die verschiedene Isoformen von Serin-β-Lactamasen der Klassen C und D umfassten, was zu einzigartigen Resistomen führte. Diese Ergebnisse eröffnen die Tür zu einem neuen Ansatz zur Analyse und Untersuchung des Problems der Multiresistenz bei Bakterien, die stark auf die β-Lactamase-Expression angewiesen sind.

Acinetobacter baumannii (Ab), ein aerober gramnegativer Kokobakterium, ist einer der ESKAPE-Krankheitserreger und wird derzeit vom CDC1 als dringende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit eingestuft. Diese Klassifizierung ist auf den Schweregrad und die hohe Mortalität (in einigen Fällen mehr als 50 %) von Infektionen mit Carbapenem-resistenten Antikörpern (CRAb) zurückzuführen2,3,4,5,6,7,8. Darüber hinaus sind diese Infektionen in der Regel nosokomial und treten häufig auf der Intensivstation auf (in manchen Fällen machen sie bis zu 31 % aller Intensivinfektionen weltweit aus), wo die Patienten bereits empfindlicher reagieren2,9,10,11,12.

Um neue Therapiestrategien zur Bekämpfung dieser Krankheitserreger zu entwickeln, ist ein tieferes Verständnis ihrer Resistenzmechanismen erforderlich. Typischerweise nutzen Bakterien eine Kombination aus Zielmodifikation, Influx-/Efflux-Regulierung, Stoffwechselveränderungen und Arzneimitteldeaktivierung durch die Expression von β-Lactamasen, aber der relative Beitrag dieser vielfältigen Strategien variiert von Pathogen zu Pathogen7,13. Obwohl beispielsweise Ab und CRAb das modifizierte Penicillin-bindende Protein (PBP) exprimieren können, wird es im Gegensatz zu Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus im Allgemeinen nicht als primärer Resistenzmechanismus angesehen14. Speziell im Hinblick auf CRAb präsentierten frühe Studien gegensätzliche Ansichten über die relative Bedeutung von PBP-Modifikationen und -Regulierung, wobei neuere Übersichten darauf hindeuteten, dass die Produktion von Carbapenemase tendenziell die bedeutendste Resistenzmethode für CRAb ist14,15,16. Carbapenemasen sind, kurz gesagt, β-Lactamasen, die neben anderen β-Lactam-Antibiotika auch Carbapeneme hydrolysieren können. Beispiele hierfür finden sich in Serin-β-Lactamasen der Klassen A und D und Metallo-β-Lactamasen der Klasse B, wobei die Serin-β-Lactamasen der Klasse D vom OXA-Typ regelmäßig in CRAb nachgewiesen werden17,18,19. Frühere Studien haben auch berichtet, dass in CRAb19 eine Vielzahl solcher β-Lactamasen vom OXA-Typ gefunden werden können; Es wurden jedoch nur begrenzte Arbeiten durchgeführt, um den gesamten Satz von β-Lactamasen in einem einzelnen Stamm selektiv zu charakterisieren und diese mit resistenten Mutanten zu vergleichen20,21,22,23.

Die Katalogisierung und Analyse der Sammlung dieser Enzyme kann daher ein entscheidender Schritt bei der Entwicklung neuartiger Kombinationstherapien sein, bei denen β-Lactamase-Inhibitoren mit β-Lactam-Antibiotika kombiniert werden. Ein aktueller Bericht zeigte sogar, dass eine neuartige Kombination von β-Lactamase-Inhibitoren bei der erfolgreichen Behandlung eines Patienten mit einer XDR-Ab-Infektion eingesetzt wird. Da Inhibitoren selbst jedoch nicht gegen alle Klassen wirksam sind, besteht die Möglichkeit, dass zukünftige β-Lactamase-Mutationen Inhibitoren unwirksam machen können24,25,26. Die Schwierigkeit dabei liegt darin, dass arzneimittelresistente Bakterien mehrere Kopien eines β-Lactamase-Gens tragen können, die nicht gleichzeitig (oder zumindest nicht im gleichen Ausmaß) exprimiert werden müssen, um ein effizientes Zellwachstum aufrechtzuerhalten. Daher können Bakterien einzigartige Sammlungen von β-Lactamasen exprimieren, was zu spezifischen Resistomen führt, die nicht nur zur Antibiotikaklasse gehören (z. B. β-Lactame), sondern auch molekülabhängig sind. Darüber hinaus ist nicht bekannt, inwieweit diese Resistome eine „Erinnerung“ an die vorherige Antibiotika-Exposition behalten und wie schnell sie sich an neue Umweltstressoren anpassen können.

Um die Antibiotikaresistenz von Bakterien und die Faktoren, die sie beeinflussen können, zu verstehen, wurden in vielen Studien verschiedene „-omische“ Ansätze verwendet, um die genetischen (genomischen), transkriptionellen (transkriptomischen), metabolischen (metabolomischen) und translationalen (proteomischen) Veränderungen zu charakterisieren, die auftreten können in Bakterien als Folge der Arzneimittelverabreichung. Unter diesen Omics liefert die Proteomik die direktesten Informationen über die bakterielle Reaktion auf äußere Reize wie den Einsatz von Antibiotika. Daher berichten viele neuere Studien über die Proteomprofile oder Proteome von arzneimittelresistenten klinischen Isolaten sowie von Bakterien mit im Labor induzierter Arzneimittelresistenz20,27,28,29,30. Typischerweise wird das gesamte Proteom gemessen und zeigt die unterschiedliche Expression zahlreicher Proteine in verschiedenen arzneimittelresistenten Bakterien, einschließlich solcher, die mit dem Stoffwechsel, dem Management reaktiver Sauerstoffspezies, Arzneimittelzielen, DNA/RNA-Modifikation usw. zusammenhängen. Im Fall der Proteome von Bei antibiotikaresistenten Ab-Stämmen beobachteten die Forscher, dass die β-Lactamase-Expression im Allgemeinen hochreguliert war20,27,31,32. Obwohl jedoch in einer kleinen Anzahl von Studien ein Zusammenhang zwischen verschiedenen Antibiotika und der Gesamtproteinexpression in Ab beobachtet wurde, gab es keine systematische Untersuchung der spezifischen Antibiotikaexposition (gleicher oder verschiedener Klassen) bei Bakterien und ihrer spezifischen enzymatischen Reaktionen. Zur Untermauerung einer solchen Studie identifizierten zwei aktuelle Berichte ausdrücklich den früheren Einsatz von Antibiotika und die Exposition gegenüber β-Lactamase-Inhibitoren als Risikofaktoren für arzneimittelresistente gramnegative Infektionen5,33. Zusammengenommen legen diese Studien und Berichte nahe, dass Gene, Proteine, Arzneimittelstrukturen und ihre spezifischen Funktionen alle miteinander verbunden sind, um Arzneimittelresistenzen zu entwickeln. Daher könnten wir die Hypothese aufstellen, dass die strukturellen Unterschiede zwischen verschiedenen β-Lactam-Antibiotika für unterschiedliche bakterielle Resistenzreaktionen in Form veränderter β-Lactamase-Expressionsmuster wichtig sein könnten.

Hier präsentieren wir die gezielte LC-MS-basierte quantitative Proteomstudie der β-Lactamase-Expression von Ab (ATCC 19606; Ab19606) als Reaktion auf die Exposition gegenüber verschiedenen β-Lactam-Antibiotika. Dies wurde durch die Trennung des zellfreien Überstands vom Bakterienwachstumsmedium mittels SDS-PAGE und anschließender LC-MS-MS-Analyse der Proteinmischung erreicht.

Zur Bestimmung und Charakterisierung der β-Lactam-Resistenz wurde Ab19606, der häufig als Kontrollstamm in Studien zur Antibiotikaresistenz eingesetzt wurde, in Nährmedien mit vier verschiedenen Klassen von β-Lactam-Antibiotika (10 µg/ml) kultiviert. Um zu bestätigen, dass durch wiederholte β-Lactam-Exposition eine Resistenz induziert wurde, wurden Scheibendiffusionstests auf Mueller-Hinton (MH)-Agar durchgeführt (Abb. 1a). Es wurde beobachtet, dass Kolonien nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C wuchsen. Im Vergleich zum arzneimittelempfindlichen Wildtyp ATCC 19606 waren die inhibitorischen Regionen bei allen Antibiotika gegen die arzneimittelresistenten Stämme reduziert: Ceftazidim (Cephalosporin) und Piperacillin (Penicillin) waren um 5 mm bzw. 6 mm sowie Imipenem reduziert (Carbapenem) und Meropenem (Carbapenem) wurden um 7 mm bzw. 5 mm reduziert. Dies bestätigte, dass Ab19606 eine signifikante β-Lactam-Resistenz gegen die exponierten Antibiotika erzeugen könnte.

(a) Der Scheibendiffusionstest wurde mit dem Wildtyp- und β-Lactam-selektierten Ab19606-Stamm durchgeführt, um die durch die Antibiotikabehandlung induzierte Resistenz zu bestätigen. Der induzierte Widerstand wurde durch Messung der Größe des Durchmessers bestimmt und der gesamte Widerstand wurde durch dreifache Wiederholungen bestätigt. (b) Experimentelles Schema der Auswahl von β-Lactam-Antibiotika und der Probentrennung/-vorbereitung für den Proteomics-Ansatz.

Um den bei diesen Organismen auftretenden Resistenzmechanismus weiter zu untersuchen, wurde Ab19606 in Nährbrühe gezüchtet und auf Agarplatten ausplattiert, die subinhibitorische Konzentrationen verschiedener Beta-Lactam- und Nicht-Beta-Lactam-Antibiotika enthielten. Die Kolonien wurden ausgewählt und in Ein-Liter-Flaschen mit Nährbrühe mit einer Konzentration von 5 μM des entsprechenden Antibiotikums gezüchtet. Sobald die Kultur die stationäre Phase erreichte, wurden die Zellen abzentrifugiert und der Überstand unter Verwendung von Ultra-15-Zentrifugalfiltereinheiten konzentriert (Abb. 1b).

Um das Vorhandensein von β-Lactamase-Enzymen aus den β-Lactam-selektierten Ab19606-Stämmen zu überprüfen, wurde Nitrocefin, ein chromogenes Cephalosporin, als kolorimetrischer Indikator verwendet34,35. Zunächst wurde dieser zellfreie Überstand mit dem Zelllysat verglichen, um sicherzustellen, dass β-Lactamasen vorhanden waren (ergänzende Abbildung S1). Typischerweise geht man davon aus, dass nur grampositive Bakterien β-Lactamasen in den extrazellulären Raum ausscheiden36. Mehrere Veröffentlichungen haben jedoch gezeigt, dass auch gramnegative Bakterien wie Ab dazu in der Lage sind37,38,39,40,41,42. Dies wird qualitativ durch unser Experiment gestützt, das die Fähigkeit des zellfreien Überstands zeigt, auch Nitrocefin zu hydrolysieren. Für alle konzentrierten, zellfreien Überstandsproben konnte die enzymatische Aktivität nachgewiesen und biochemische Aktivitätsparameter (z. B. Km, kcat) durch Variation der Nitrocefinkonzentration von 0, 01 bis 75 μM ermittelt werden (Tabelle 1, ergänzende Abbildung S2). Als positive Kinetikkontrolle wurde eine Probe gereinigter TEM-1-β-Lactamase verwendet. Die scheinbaren Km- und kcat-Ergebnisse sind mit den kinetischen Parametern der TEM-1-Kontrolle vergleichbar und zeigen einen angemessenen Bereich für kcat/Km43. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nicht nur β-Lactamase-Enzyme im konzentrierten zellfreien Überstand vorhanden waren, sondern dass diese auch innerhalb eines geeigneten Konzentrationsbereichs lagen und dass eine weitere Charakterisierung durchgeführt werden konnte.

Zur Visualisierung und Trennung der von Ab19606 exprimierten β-Lactamasen führten wir in Vorbereitung auf die LC-MS eine SDS-Geltrennung der hochkonzentrierten Überstandsproben durch, die aus Ab19606-Proben nach 72-stündiger Exposition gegenüber 5 μM Antibiotika stammten (Abb. 2a). Als positive Kontrolllinie wurde eine gereinigte Klasse-A-β-Lactamase (TEM-1, 29 kDa/Linie 1) verwendet. Nach der SDS-PAGE waren die D-Lactamase-Proteine nach beiden Coomassie-Blau-Färbungen gut sichtbar. Mehrere Spuren mit Überständen verschiedener β-Lactam-exponierter Ab19606-Proben (Proben 1–9) zeigten eine deutliche Bande an einer Stelle, die einer Größe zwischen 27,5 und 42 kDa entsprach, was der Expression von β-Lactamasen entspricht. Interessanterweise war die Intensität der Banden unterschiedlich und die getrennten Proteingelbanden zeigten je nach dem zur Resistenzinduktion verwendeten Antibiotikum unterschiedliche Proteinmuster und Expressionsniveaus.

(a) SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung zellfreier Überstandsproben. Als Kontrolle wurde gereinigte TEM-1-β-Lactamase verwendet. Der mögliche Bereich des Gels, der alle Klassen von β-Lactamase-Proteinen enthielt (rotes Quadrat), wurde zur weiteren Proteomikanalyse ausgeschnitten. (b) Relative Anteile der nach Antibiotika-Exposition exprimierten β-Lactamasen. ADC und AmpC sind β-Lactamasen vom Typ C; OXA ist Typ D; TEM ist Typ A; PBP ist das Ziel von β-Lactam-Antibiotika, weist jedoch strukturelle Ähnlichkeiten und ein ähnliches Molekulargewicht auf.

Nach der erfolgreichen Trennung der Proteine mittels SDS-Gelelektrophorese wurden Abschnitte des Gels, die die β-Lactamase-Proteine enthielten (rote Bereiche in Abb. 2a), für die Proteomanalyse geschnitten. Die LC-MS/MS-basierten Proteomik-Experimente wurden unter Verwendung einer markierungsfreien Proteomik-Methode (MaxLFQ) zur Identifizierung der von den arzneimittelresistenten Kolonien exprimierten β-Lactamase-Isoformen durchgeführt. Genauer gesagt wurde die Probenvorbereitung durch tryptischen Aufschluss durchgeführt und die aufgeschlossenen Proben wurden mittels hochauflösender Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert. Die identifizierten Peptide wurden dann mithilfe von Mascot, Proteome Discoverer und MSFragger unter Verwendung einer FASTA-Datei analysiert und bewertet, die eine Ab19606-β-Lactamase-Sequenzdatenbank umfasst.

In allen Proben wurden verschiedene Sequenzen identifiziert, die mit mindestens zwei eindeutigen Peptidsequenzen mit verschiedenen β-Lactamase-Isoformen übereinstimmen (Tabelle 2). Die relative Häufigkeit dieser Isoformen wurde dann verglichen, indem die markierungsfreie Intensität auf die insgesamt gemessene Intensität für die Probe normalisiert wurde. Anschließend wurden verschiedene Proteine, die zu einer größeren Klasse gehören, zusammengefasst, z. B. OXA-51 und OXA-66 zu einer OXA-Gruppe zusammengefasst (Abb. 2b). Obwohl in der Proteomikanalyse auch verschiedene Nicht-β-Lactamase-Proteine identifiziert wurden, waren die bekanntesten Proteintypen Ampicillinase C (AmpC), Acinetobacter-derived AmpC (ADC) und Oxacillinase (OXA), die sowohl zur Klasse C als auch zur Klasse D gehören Enzyme (Abb. 2b, ergänzende Abb. S3). Wichtig ist, dass die Expression dieser Enzyme durch Ab19606 mit dem Vorhandensein der von der ATCC katalogisierten blaAmpC- und blaOXA-Gene übereinstimmt.44 Interessanterweise wurde beobachtet, dass die relativen Mengen dieser drei Arten von β-Lactamase-Proteinen je nach Antibiotikum deutlich unterschiedlich waren welches Ab19606 freigelegt wurde. Diese Daten legen nahe, dass die Expression von β-Lactamasen durch die spezifische Antibiotikabehandlung beeinflusst werden kann, insbesondere in Fällen, in denen Ab19606 Antibiotikakonzentrationen über seiner MHK ausgesetzt war. Dieses Konzept wird weiter durch die Beobachtung gestützt, dass diese aktiven Resistenzprofile auch für Antibiotika derselben Klasse unterschiedlich sind. Penicillin G (penG), Amoxicillin (Amox) und Piperacillin (Pipe) sind beispielsweise allesamt β-Lactam-Antibiotika der Penicillin-Klasse, rufen jedoch recht unterschiedliche Reaktionen hervor (Abb. 2b, ergänzende Abb. S3).

Antibiotika haben der Menschheit im letzten halben Jahrhundert einen erfolgreichen Vorsprung gegen Krankheitserreger verschafft. Allerdings verschaffen Mutationen und natürliche Selektion in Kombination mit schnellen Generationszeiten und enormen Populationsgrößen den Krankheitserregern nun einen entscheidenden Vorteil45,46,47,48. Um wieder die Oberhand zu gewinnen, ist es wichtig, die Beziehung zwischen der Struktur und Funktion von Antibiotika besser zu verstehen und zu verstehen, wie sich Krankheitserreger systematisch weiterentwickeln können, um sie zu untergraben, sodass neue Behandlungsstrategien entwickelt werden können.

Bakterien haben gegen viele der derzeit verwendeten Klassen antimikrobieller Wirkstoffe zunehmend Resistenzen entwickelt. Einige Bakterien, wie z. B. Ab, neigen dazu, ein hohes Maß an Arzneimittelresistenz zu entwickeln und werden daher als extensiv arzneimittelresistent (XDR) und pan-arzneimittelresistent eingestuft6,46,49,50. Unsere Wahl der Ab19606- und β-Lactam-Antibiotika wurde daher insbesondere durch die Tatsache beeinflusst, dass CRAb von der CDC mittlerweile als vorrangige Bedrohung angesehen wird, da nach einer Infektion nur wenige Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen1,46,51. Darüber hinaus wird eine Carbapenem-Resistenz häufig bei Stämmen gefunden, die als MDR oder XDR50,52,53 gelten. Obwohl Ab und CRAb, wie viele Bakterien, über mehrere Resistenzmodi verfügen, sind einige der Ansicht, dass die Deaktivierung von β-Lactamen durch die Wirkung von β-Lactamasen der wichtigste Mechanismus sein könnte54,55. Dies stellt mehrere Herausforderungen dar, da die β-Lactamasen zahlreich sind, eine hohe Ähnlichkeit aufweisen, leicht zwischen Bakterien übertragbar sind und leicht mutieren, um in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen eine größere Aktivität bereitzustellen. Wir sind jedoch der Ansicht, dass dieselben Merkmale auch eine Möglichkeit bieten könnten, die unspezifischen oder unbeabsichtigten Wechselwirkungen von Antibiotika mit Bakterien, die zu Resistenzen führen, zu erfassen.

Unsere in Abb. 2 und der ergänzenden Abb. S3 dargestellten Ergebnisse zeigen die Variabilität der β-Lactamase-Expression, die als Folge einer Antibiotika-Exposition auftreten kann. Wichtig ist, dass alle Antibiotika zu Expressionsprofilen führten, die sich deutlich von denen des Wildtyp-Ab19606 unterschieden, bei dem festgestellt wurde, dass er überwiegend ADC exprimiert. Einzigartige Sequenzen konnten jedes Enzym identifizieren und wurden für die MaxLFQ-Quantifizierung der Proteinexpression verwendet. Wir zeigen außerdem durch direkten Sequenzvergleich, dass die Enzyme ADC (A0A5C1K4D3) und AmpC (A0A009PJF4 bis A0A8D6JWD9) tatsächlich einzigartige Isoformen sind (Abb. 3)56.

Mehrfachsequenzvergleich der identifizierten AmpC- (A0A009PJF4 bis A0A8D6JWD9) und ADC- (A0A5C1K4D3) Isoformen. Rot zeigt an, dass der Rest mit der Referenzsequenz (AmpC) übereinstimmt. Die Abbildung wurde mit dem Programm prime, einem Schrödinger-Paket, generiert.

Die Abdeckungskarten dieser und anderer identifizierter Proteine sind in der ergänzenden Abbildung S4 aufgeführt. Interessanterweise wiesen die β-Lactamasen der Klasse C, zu denen AmpC und ADC gehören, eine sehr hohe Variabilität zwischen den verschiedenen Ab19606-Proben auf, scheinen jedoch eine Abhängigkeit von der β-Lactam-Unterklasse aufzuweisen (ergänzende Abbildung S5). Genauer gesagt exprimierten mit Carbapenem behandelte Proben (insbesondere Meropenem und Imipenem) das meiste AmpC (A0A009KWD8) mit einem großen Anteil an ADC. Dementsprechend führten Proben, die mit den häufigeren aus Penicillin abgeleiteten β-Lactamen wie Penicillin G, Amoxicillin und Piperacillin behandelt wurden, im Allgemeinen alle zu viel größeren Anteilen an AmpC (A0A0R4J6T7). Dieser Unterschied könnte darauf zurückzuführen sein, dass Klasse-C-β-Lactamasen nicht in der Lage sind, Carbapeneme zu spalten, während sie Penicilline oder Cephalosporine leicht hydrolysieren14,17,57. Dies würde darauf hindeuten, dass die mit Carbapenemen behandelten Bakterien einem größeren Stress ausgesetzt sind, was zu einer stärkeren β-Lactamase-Expression und einem höheren Grad an Mutation sowie dem größeren Vorhandensein verwandter Isoformen führt.

Dasselbe Konzept scheint sich auf die variable Expression von OXA- und PBP-Proteinen zu erstrecken, auch wenn kein klarer Trend beobachtet werden kann. Die variable Expression von OXA ist jedoch wichtig, da diese Klasse-D-β-Lactamasen bekannte Carbapenemasen sind und an der Entwicklung von CRAb17,19,52 beteiligt sind. Aus unseren Daten geht hervor, dass alle β-Lactame der Carbapenem-Klasse die Expression von OXA induziert haben, wobei Meropenem und Faropenem die größte relative Menge unter allen Proben ergaben. Es ist unklar, warum Imipenem diesem Trend nicht unbedingt folgte oder warum Penicillin, Amoxicillin und Piperacillin alle unterschiedliche, aber geringere OXA-Expressionsniveaus aufweisen.

Die Beobachtung dieser anfänglichen Unterschiede zwischen β-Lactam-Klassen und sogar zwischen Verbindungen derselben Unterklasse ist vielversprechend und lässt auf einen komplexeren Zusammenhang zwischen Antibiotikastruktur und Resistenzentwicklung schließen als bisher berichtet. Dennoch ist unklar, wie gut diese Studien mit der In-vivo-Resistenzentwicklung korrelieren, da die Konzentration der Verbindung in vivo stark schwankt und von der Verteilung, dem Metabolismus und der Bakterienzahl beeinflusst wird. Darüber hinaus konnte unsere Studie die Auswirkungen, die polymikrobielle Populationen aufgrund des Gentransfers auf die Resistenz haben könnten, nicht berücksichtigen.

Mithilfe einer markierungsfreien proteomischen Methode, bei der die in einer zellfreien Überstandslösung vorhandenen β-Lactamasen analysiert wurden, wurde beobachtet, dass Ab19606 für jedes angewendete β-Lactam-Antibiotikum unterschiedliche Profile von β-Lactamasen erzeugt hatte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das spezifische β-Lactam, also seine Struktur, dieselben Bakterien unterschiedlich beeinflussen kann, was darauf hindeutet, dass ein komplizierterer Zusammenhang zwischen der Struktur/Funktion des Antibiotikums und der Resistenzbildung besteht. Zukünftige Studien werden die Möglichkeit untersuchen, dass diese Variation innerhalb der Klassen existiert und nicht zufällig ist, und ob konzentrationsabhängige Trends identifiziert werden können. Die weitere Aufklärung solcher Zusammenhänge würde nicht nur unser Verständnis der bakteriellen Resistenzmechanismen erheblich erweitern, sondern könnte auch zu entscheidenden neuen Werkzeugen für die Entwicklung von Antibiotika oder Kombinationstherapien der nächsten Generation führen, die möglicherweise die Hemmung oder Umgehung von β- Lactamase-basierte Resistenz.

Ab19606 wurde über Nacht in Nährbrühe bei 37 °C gezüchtet. Die Kultur wurde auf 0,5 McFarland-Standard (1,5 × 108 KBE/ml) verdünnt und 100 μl auf Mueller-Hinton-Agar verteilt. Entsprechend dem Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) wurden den 6-mm-Scheiben entsprechende Mengen an Antibiotika zugesetzt. Die Platten wurden 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, bevor die Hemmzonen bestimmt wurden. Für die anschließende Exposition wurden Bakterien entlang der Hemmzone einer Scheibe gesammelt und in Nährbrühe erneut kultiviert. Die Zellen wurden auf die gleiche Weise vorbereitet, jedoch verfügte jede Scheibendiffusionstestplatte nur über Antibiotikascheiben (3x), die mit denen der Scheibe übereinstimmten und so die Hemmzone bildeten, aus der die Bakterien gesammelt wurden. Nachfolgende Tests wurden durchgeführt, bis Mutationen auftraten, die das Auftreten von Resistenzen ermöglichten, typischerweise in 2–3 Passagen.

Ab19606 wurde über Nacht bei 37 °C in Nährbrühe gezüchtet und auf 0,5 McFarland-Standard (1,5 × 108 KBE/ml) verdünnt. Um die Expression von β-Lactamasen zu induzieren, wurden Kulturen von Ab19606 auf Nähragarplatten mit subinhibitorischen Konzentrationen an Antibiotika zur Kolonieisolierung unter Verwendung der Streifenmethode ausgebreitet und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Kolonien ausgewählt und unter Schütteln 72 Stunden lang bei 37 °C in 1 l Nährbrühe mit 5 μM des gleichen Antibiotikums, das für die Selektion verwendet wurde, gezüchtet.

Die zuvor beschriebenen Ein-Liter-Kulturen wurden zur Analyse der durch das im Medium vorhandenen Antibiotikum induzierten β-Lactamase-Produktion verwendet. Nach 72-stündiger Inkubation wurde das Medium zweimal zentrifugiert (8000 × g, 10 Min.). Wir haben den geklärten Überstand durch einen 0,2-μm-Spritzenfilter filtriert, um alle verbleibenden bakteriellen Krankheitserreger zu entfernen. Der gesamte Überstand wurde dann unter Verwendung von Millipore Sigma Ultra-15-Zentrifugalfiltereinheiten mit einem Cutoff von 10 kDa (Katalog-Nr. UFC901008) konzentriert.

TEM-1 wurde in Escherichia coli BL21 (DE3) mit dem pET-TEM-1-Vektor exprimiert, durch osmotischen Schock extrahiert und durch Zn-Chelat-Chromatographie und Gelfiltration (Sephacryl-100) gereinigt. Zur Lagerung wurden 50 mM Tris, pH 8,0 und 150 mM NaCl verwendet.

Die gereinigte TEM-1- und β-Lactamasen-Aktivität im Überstand wurde spektrophotometrisch (Spectramax-M5-Reader) bei Raumtemperatur in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) bestimmt, was zur Enzymstabilität bei diesen Volumina in einem Gesamtvolumen von 100 beiträgt µl unter den Bedingungen mit Nitrocefin (ε486 nm = 20.500 M−1 cm−1) als Reportersubstrat. Nitrocefin (0,001 bis 100 μM) wurde frisch in 50 mM Kaliumpuffer (pH 7,0) hergestellt. Die scheinbaren Km- und kcat-Werte wurden aus mindestens vier unabhängigen Anfangsgeschwindigkeitsmessungen durch Anwendung einer nichtlinearen Regressionsanpassung mit dem Michaelis-Menten-Enzymkinetikmodell in GraphPad Prism 9 abgeleitet.

Konzentrierte Überstandsproben (7,5 μl) wurden in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 2 × Laemmli-Pufferfärbung, Bio-Rad (2,5 μl), gemischt. Die Proben wurden 10 Minuten lang in einem Wasserbad auf 100 °C erhitzt und anschließend zentrifugiert (12.000 U/min, 10 Minuten). Die Proteine im Überstand antibiotikaselektierter bakterieller Krankheitserreger wurden durch SDS-PAGE 10 % Gradient Novex Tris-Glycin-Auflösungsgel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aufgetrennt. Nach der Elektrophorese-Trennung bei 130 V für 1 Stunde wurde das Gel 20 Minuten lang in 50 % MeOH, 10 % HoAC, 40 % H2O fixiert. Die Gele wurden in eine Plastikschale gegeben, die ein geeignetes Volumen (100–250 ml) Färbelösung (0,25 % Coomassie Blue R-250) enthielt, bis das Gel eine gleichmäßige blaue Farbe hatte. Die Färbung war abgeschlossen, als das Gel in der Farbstofflösung nicht mehr sichtbar war. Zum Entfärben des Gels wurden 5 % MeOH und 7,5 % HoAC in 87,5 % dH2O verwendet, bis der Hintergrund transparent war. Die Gele wurden in 7 % HoAC gelagert.

Für den Proteinverdau wurden die Banden, um überschüssiges Polyacrylamid zu minimieren, geschnitten und in mehrere kleinere Stücke geteilt. Die Gelstücke werden mit Wasser gewaschen und in Acetonitril dehydriert. Die Banden wurden dann mit DTT reduziert und vor dem In-Gel-Verdau mit Iodacetamid alkyliert. Alle Banden wurden im Gel mit Trypsin verdaut, indem 5 μl 10 ng/μl Trypsin oder Chymotrypsin in 50 mM Ammoniumbicarbonat zugegeben und der Verdau über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert wurde, um einen vollständigen Verdau zu erreichen. Die gebildeten Peptide wurden aus dem Polyacrylamid in zwei Aliquots von 30 μl 50 % Acetonitril mit 5 % Ameisensäure extrahiert. Diese Extrakte wurden kombiniert und in Speedvac auf < 10 μL eingedampft und dann in 1 % Essigsäure resuspendiert, um ein Endvolumen von ~ 30 μL für die LC-MS-Analyse zu erreichen. Das LC-MS-System war ein Bruker TimsTof Pro2 Q-Tof-Massenspektrometriesystem, das im positiven Ionenmodus arbeitete, gekoppelt mit einer CaptiveSpray-Ionenquelle (beide von Bruker Daltonik GmbH, Bremen). Die HPLC-Säule war eine Bruker 15 cm × 75 μm ID C18 ReproSil AQ, 1,9 μm, 120 Å Umkehrphasen-Kapillarchromatographiesäule. Ein μL-Volumen des Extrakts wurde injiziert und die Peptide, die durch einen Acetonitril/0,1 % Ameisensäure-Gradienten mit einer Flussrate von 0,3 μL/min aus der Säule eluiert wurden, online in die Quelle des Massenspektrometers eingeleitet. Die Verdauungen wurden mithilfe einer Parallel Accumulation-Serial Fragmentation DDA-Methode analysiert, um Vorläuferionen für die Fragmentierung mit einem TIMS-MS-Scan, gefolgt von 10 PASEF MS/MS-Scans, auszuwählen. Der TIMS-MS-Vermessungsscan wurde zwischen 0,60 und 1,6 Vs/cm2 und 100–1700 m/z mit einer Rampenzeit von 166 ms erfasst. Die Gesamtzykluszeit für die PASEF-Scans betrug 1,2 s und die MS/MS-Experimente wurden mit Kollisionsenergien zwischen 20 eV (0,6 Vs/cm2) und 59 eV (1,6 Vs/cm2) durchgeführt. Vorläufer mit 2–5 Ladungen wurden ausgewählt, wobei der Zielwert auf 20.000 AU und der Intensitätsschwellenwert auf 2500 AU eingestellt waren. Vorläufer wurden 0,4 s lang dynamisch ausgeschlossen. Die Daten wurden analysiert, indem alle im Experiment gesammelten CID-Spektren verwendet wurden, um eine mit Uniprot zusammengestellte Ab-Datenbank mit dem Programm MSFragger zu durchsuchen. Die Parameter für diese Suche umfassen eine Vorläufer-Massengenauigkeit von 20 ppm und eine Fragment-Massengenauigkeit von 0,05 Da, vollständig tryptische Peptide mit zwei erlaubten fehlenden Spaltungen, oxidierte Methionin- und Protein-N-terminale Acetylierung als variable Modifikationen und Carbamidomethylierung als statische Modifikation. Die Protein- und Peptididentifizierung wurde mithilfe einer Täuschungsdatenbankstrategie auf 1 % FDR validiert.

Unsere Sequenz-Alignment-Methode wurde auf unkomplizierte Weise für die Datenbanksuche verwendet. Die Tools zur Ausrichtung mehrerer Sequenzen im Schrödinger-Paket ver. 2019-3 basierend auf dem klassischen Smith-Waterman-Algorithmus wurden verwendet. Die vergleichende Sequenzdatenbank wurde von UniProt und der NCBI Protein Data Bank bereitgestellt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Außerdem wurden die Massenspektrometrie-Proteomikdaten über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD042336 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

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Forschungsunterstützung für Woo Shik Shin wurde von der Northeast Ohio Medical University, College of Pharmacy, bereitgestellt. Die Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften der Northeast Ohio Medical University stellte alle notwendigen Forschungsressourcen zur Verfügung.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (1R01AG076699 an Woo Shik Shin) und einen Start-up-/Translational Research Seed Grant der Northeast Ohio Medical University unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Trae Hillyer und Bogdan M. Benin.

Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften, Northeast Ohio Medical University, Rootstown, OH, USA

Trae Hillyer, Bogdan M. Benin, Noah Aguirre und Woo Shik Shin

Abteilung für Neurologie, University of California, Los Angeles, CA, USA

Chuanqi Sun

Proteomics and Metabolomics Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA

Belinda Willard

Abteilung für Integrative Biologie und Physiologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA

Yuk Yin Sham

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TH und NA züchteten Ab19606-Proben und bereiteten Proben für die Proteomik vor. BW führte Proteomikmessungen und Peptididentifizierung durch. CS reinigte und stellte das TEM-1-Kontrollprotein bereit. BMB analysierte die Ergebnisse. BMB und WSS haben das Manuskript geschrieben. WSS überwachte die Arbeiten. WSS und YYS haben das Projekt entworfen. TH und BMB haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Woo Shik Shin.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hillyer, T., Benin, BM, Sun, C. et al. Eine neuartige Strategie zur Charakterisierung des Musters der durch β-Lactam-Antibiotika induzierten Arzneimittelresistenz bei Acinetobacter baumannii. Sci Rep 13, 9177 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36475-9

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Eingegangen: 08. Dezember 2022

Angenommen: 04. Juni 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36475-9

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